2018 Fiscal Year Research-status Report
結核菌タンパク質PE_PGRS30のPHB2を介したアポトーシス誘導機構の解析
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18K07134
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| Research Institution | National Center for Global Health and Medicine |
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Principal Investigator |
松村 和典 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 研究員 (70537670)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 結核菌 / マクロファージ / PE_PGRS30 / PHB2 / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
結核は、今なお対策が必要な感染症であり、結核菌の病原性解明が求められているが、細胞間伝播の機序は不明な点が多い。我々は、結核菌タンパク質PE_PGRS30をマクロファージ様細胞株RAW264.7に発現させると、細胞死のうち、アポトーシスが誘導されることを見出した。GFPを発現させると、時間経過とともに、発現細胞数は増加する。一方、PE_PGRS30は、12時間以降、発現細胞数は増加しなくなる。発現細胞の核とミトコンドリアを染色したところ、核の凝集・断片化及びミトコンドリアの電位散逸がみられ、それらの特徴を有する細胞数は、時間経過とともに増加した。さらに、アポトーシスを実行するCaspase-3の活性化を免疫染色により確認したところ、核の凝集・断片化及びミトコンドリアの電位散逸のみられる細胞は、Caspase-3が活性化していた。これらの結果から、PE_PGRS30の発現はアポトーシスを誘導することが示唆された。PE_PGRS30がアポトーシスを誘導するための標的因子を探索するべく、精製したPE_PGRS30とRAW264.7の破砕液を混合しプルダウンアッセイを行った結果、遺伝子発現やミトコンドリア維持に関与する宿主タンパク質プロヒビチン２（PHB2）を同定した。細胞内の免疫沈降実験によりPE_PGRS30とPHB2の相互作用を確認した。PE_PGRS30は、PE・PGRS・C末端領域の３つのドメインに分かれている。一方、 PHB2は、核移行シグナルを含む領域とミトコンドリア局在シグナルを含む領域の２領域に分かれている。それぞれを組換えタンパク質として作成し、in vitroでの結合実験により、PE_PGRS30はPGRSドメイン、PHB2はミトコンドリア局在シグナルを含むＮ末端領域が、それぞれ相互作用領域となっていることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで、結核菌タンパク質PE_PGRS30が細胞死を誘導する可能性が示唆されていたが、詳細は明らかにされていなかった。現在まで、本研究では、PE_PGRS30の誘導する細胞死はアポトーシスであること、PE_PGRS30がマクロファージ内で標的とする因子が、PHB2であること、マクロファージ内及び試験管内でも、PE_PGRS30とPHB2が結合し、また、それぞれの相互作用領域を示唆する結果を得た。よって、結核菌のPE_PGRS30がマクロファージ内でPHB2と相互作用することで、アポトーシスが誘導される機構を想定することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
・組換えPE_PGRS30によるアポトーシス誘導：PE_PGRS30は、結核菌培養時の培養上清に含まれていることを確認している。そこで、PE_PGRS30のアポトーシス誘導ドメインを大腸菌に発現させ、精製した組換えタンパク質をマクロファージに添加することで、アポトーシスが誘導されるか検討する。
・PHB2の細胞内局在と機能阻害：マクロファージにPE_PGRS30を発現させるか、組換えPE_PGRS30を添加して、PHB2の局在が変化するか、また、PE_PGRS30との共局在を検討する。PHB2は、OPA1の長さを保持することでミトコンドリアの構造を維持しており、OPA1が短くなるとアポトーシスが誘導される。PE_PGRS30を発現・作用したときのOPA1の長さを検出し、アポトーシス誘導と関係があるか検討する。
・PE_PGRS30の結核菌病原性への寄与及びPHB2の宿主抗結核免疫への寄与：PE_PGRS30欠損結核菌のマウス感染実験（生死観察、肺の生菌数測定）により、PE_PGRS30の結核菌病原性への寄与を明らかにする。また、肺の組織染色からPE_PGRS30のアポトーシス誘導への寄与を明らかにする。さらに、PHB2ノックアウトマウスは胎生致死のため、PHB2コンディショナルノックアウトマウスを作出し、結核菌感染実験（生死、肺の生菌数測定、肺切片組織染色）により、PHB2の宿主抗結核免疫への寄与を明らかにする。
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