2018 Fiscal Year Research-status Report

Development of Inhibitors for Influenza Endonuclease Activity

Research Project

Project/Area Number	18K07138
Research Institution	Chiba University
Principal Investigator	星野忠次千葉大学, 大学院薬学研究院, 准教授 (90257220)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	インフルエンザ / エンドヌクレアーゼ活性 / 阻害剤 / 薬物設計 / 計算機解析 / 有機合成 / X線結晶構造解析 / 阻害活性測定
Outline of Annual Research Achievements	インフルエンザ治療薬候補化合物の創出を目的とし、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼに内包されているエンドヌクレアーゼ活性部位を標的として薬物の開発を進めた。準備研究の段階で、化合物スクリーニングにより、３種類の阻害物質を同定し、いずれもウイルスの増殖を抑えること、このうちの２つにはほとんど細胞毒性が認められないという知見を得ていた。さらにいずれの化合物についても、エンドヌクレアーゼ活性部位との共結晶構造解析に成功し、化合物の構造改変への指針を得ていた。本年度は、上記の３つの化合物のうちの一つに絞り、化合物合成を進めた。具体的には、結晶構造解析の結果に基づいて、幾つかの変換構造を考案し、計算機で結合構造予測を行った。予測構造から化合物と活性部位との結合親和性を計算機上で結合スコアーとして算出し、算出したスコアー値を参考に合成する化合物構造を決定した。合成した化合物の中に、３種類、最初に同定した化合物よりも阻害活性の高いものが見出された。同定された阻害化合物群は、芳香環に複数のOH基が結合したポリフェノール構造を持ち、この部位がエンドヌクレアーゼ活性部位に存在する２価金属に配位結合することで、阻害効果を発揮する。複数のOH基が結合したポリフェノール構造は化学的に必ずしも安定でないため、有機合成における反応条件の設定が難しかったが、目的とした化合物の骨格構造が得られる合成経路を見つけることができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 準備研究で同定した化合物に比べ、活性の向上した３化合物を得ることができたため。また共結晶構造解析に向けて、エンドヌクレアーゼ活性部位を抜き出した部分タンパク質で結晶を得る作業も進めることができたため。
Strategy for Future Research Activity	標的タンパク質のエンドヌクレアーゼ酵素活性は、RNAだけでは無く１本鎖DNAも切断する。取り扱いが容易なことから、RNAではなくDNAを基質として使用する。合成した化合物については、一定時間内におけるDNAの分解量を、DNA染色後の発光量から評価する。より正確な酵素阻害活性の測定を行うために、20塩基程の１本鎖DNAの一方の末端に蛍光物質(FAM)を、もう一方の末端に光吸収物質(BHQ)を結合させたプローブを委託合成する。酵素活性により、プローブDNAが切断されると蛍光が観察される。異なる濃度の化合物存在下で、プローブ切断酵素反応の速度をプレートリーダーで測定することで、化合物の阻害能(IC50値)を求める。また結晶構造解析を行う。エンドヌクレアーゼ活性部位は、RNAポリメラーゼのドメインＡのＮ末側の200残基弱の部分に存在する。このエンドヌクレアーゼ活性部位を部分タンパク質として発現して精製する。タンパク質結晶を、化合物の結合していないアポ体として作出し、後からソーキングの手法で化合物との共結晶を調整する。これまでの準備研究で、既に共結晶が作出できるようになり、2.0Å以下の分解能で複合体構造が解けている。Ｘ線回折実験は、つくば高エネルギー加速器研究機構内のフォトンファクトリー施設で高輝度Ｘ線源を用いて行う。さらに研究協力者の順天堂大学の山本典生博士に依頼して、合成化合物の存在下で、インフルエンザウイルスが他の細胞へ感染する能力を定量化する。タンパク質レベルの阻害活性は、H1N1型のインフルエンザウイルスのアミノ配列を持つ組み換えタンパク質で測定している。そこで初めにH1N1型のウイルス株で化合物の感染阻害の活性測定を行う。H1N1型としてインフルエンザPR8ウイルス株を用いる。