Molecular mechanism of viral suppression by APOBEC3

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07142
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 伊藤 暢聡 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (40361703)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 蛋白質間相互作用 / 抗ウイルス蛋白質

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、哺乳類の抗レトロウイルス蛋白質であるAPOBEC3のデアミナーゼ活性非依存性のウイルス抑制機構の解明をめざして、マウスのAPOBEC3とウイルス側蛋白質因子との相互作用を、Ｘ線結晶解析や熱力学的解析を基軸として研究することを目的としている。今年度は、前年度に引き続き、APOBEC3蛋白質の発現系・精製方法の改善と結晶化に取り組んだ。
１．蛋白質試料の改善
マウスのAPOBEC3は二つのZドメインから構成されるが、前年度の段階でカルボキシル末端側Zドメインについては、大腸菌を用いたバクテリア発現系の構築自体には成功していたものの、発現された蛋白質の可溶性に問題があり、結晶化実験に供される試料の量に制限があった。今年度は、発現条件や精製方法に検討を加えた結果、カルボキシル末端側Zドメインについて可溶性が大きく改善され、最終的な収量も多くなった。得られた試料はSDS-PAGEや動的光散乱法などで、その品質の確認も行っている。全長蛋白質についても、カルボキシル末端側Zドメイン同様、可溶性の問題について種々の検討を行ったが、今年度において改善を試みたものの大きな改善は見られなかった。
２．上記１で今年度性質が大きく改善されたカルボキシル末端側Zドメイン試料を中心として、ハンギングドロップ法とシッティングドロップ法を併用して幅広い結晶化スクリーニングを行った。その結果、いくつかの条件下で微小な結晶が得られたが、まだ構造決定に十分な性質をもつものは得られていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

蛋白質試料の可溶性の改善に想定より時間がかかり、結晶化実験に十分な資料を得るのがやや遅れた。微小な結晶は得られているものの、構造解析に適した質のものは得られていないため、上記のように判断した。

Strategy for Future Research Activity

今年度にひき続き、カルボキシル末端側Zドメインの結晶の改善と、全長蛋白質の発現系の改善（主に可用性に関して）を行うが、特に前者に注力する。結晶が得られた場合は、直ちに構造解析を行う。
今年度の成果として、カルボキシル末端側Zドメインの性質のよい高濃度試料が初めて得られたので、表面プラズモン共鳴法（SPR）や等温滴定型カロリメトリー（ITC）などの手法を用いて、溶液系での相互作用測定を行う。結晶構造が得られている場合、変異体の作成と組み合わせることにより、より詳しい相互作用を明らかにする。

Causes of Carryover

十分な質の結晶が得られなったため、一部実験が遅れたため。この実験は来年度行う予定である。