2018 Fiscal Year Research-status Report
新規遺伝子操作系を利用したロタウイルス下痢症発症機序の解明
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18K07145
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
金井 祐太 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (80506501)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ロタウイルス / 下痢症 / リバースジェネティクス / ワクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ロタウイルス（RV）は乳幼児に重篤な下痢症を引き起こす、公衆衛生上重要なウイルスである。RVのNSP4タンパク質はウイルス性腸管毒素として知られているが、これまでの研究は組換えNSP4タンパク質を用いた生化学的な解析のみに限られていた。我々は2017年に世界初となるRVの完全な遺伝子操作系を報告し、任意の変異を加えた組換えRVを自在に作製できることを示した。本研究では、遺伝子操作系によりNSP4遺伝子に任意の変異を加えた組換えロタウイルスを作製することで、RV感染によるNSP4タンパク質の生物学的機能の解明を試みた。
まずNSP4の下痢発症に関与するドメインを探索するために、RV SA11株のNSP4遺伝子に網羅的にアラニン置換を導入したNSP4変異RV株を計40株作製した。これらのNSP4変異RV株の殆どはサル腎由来MA104細胞において野生型SA11株と同程度の増殖能を示したが、Viroporinドメインとして細胞内カルシウムの調節に重要であるとされているK62、K66、K69の内、2か所以上のアミノ酸に同時に変異を導入した組換えSA11株の増殖能は極度に低下し、数回の継代後には復帰変異が認められたことから、カルシウムの調節がロタウイルスの増殖に重要であることが示唆された。
我々が使用しているサルロタウイルスは、マウスへの感染能が低いとされていた。そこでSA11株を用いたマウスでの下痢発症能の評価系を構築するために、生後4、5、6、7日齢のBalb/cマウスにSA11株を経口投与したところ、生後4、5、6日齢のマウスでは感染48時間後に下痢のピークを認めたが、その発症率は生後4日齢で最も高く、日齢が進むにつれ下痢を呈する個体数は低下し、生後7日齢のマウスは下痢を示さなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は以下の３項目を基盤計画として進めている。1）NSP4下痢症発症ドメイン変異ウイルスのマウスにおける病原性解析、2）NSP4下痢発症機能変異ウイルスの生理学的機能解析、3）NSP4ウイルス粒子形成ドメイン変異ウイルスのウイルス複製能への影響。（1）について、初年度は多数のNSP4変異ウイルスを作製し、培養細胞での増殖能の比較を行った。野生型SA11を用いたマウス感染実験の条件検討が完了できたため、次年度はこれらのウイルスをマウスに接種し、病原性解析を行う予定である。（2）についても（1）で作成した変異ウイルスを用いて培養細胞における詳細な検討を行う予定である。（3）については、作製したNSP4変異ウイルスの内、N末端領域の欠損変異体の増殖能が極度に低下することが分かった。欠損領域を数アミノ酸変えると複製能は元に戻り、必ずしも欠損領域の長さに依存しないことからNSP4の高次構造に起因するものであると考えられた。また、組換えNSP4タンパク質を用いて行われた過去の報告で、NSP4のViroporinドメインとされている、K62、K66、K69のアミノ酸をそれぞれ単独でアミノ酸置換を行ってもウイルス複製能に影響しないが、これらを2個以上同時に改変することで、ウイルス複製能が極端に低下することが明らかとなった。NSP4のViroporinとしての機能は細胞内カルシウムの調節に寄与していると考えられていることから、次年度はこれらのNSP4変異株を用いた詳細な検討を行っていきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度は多数のNSP4変異ロタウイルス株の作製に成功し、一部はウイルス複製能に大きく影響することが明らかとなった。今後は、同定されたアミノ酸領域周辺部にさらに変異を加え、in vitro解析に有用なウイルス株の補完を目指す。また得られたNSP4変異ウイルス株を随時マウスに感染し、下痢発症能が低下したウイルス株の探索を行う。培養細胞で増殖能が低下したウイルス株については、ウイルス感染の吸着、侵入、脱殻、ゲノム複製、アセンブリーのそれぞれの過程における効率を調べ阻害されるステップを同定する。特に以前より示唆されている細胞内カルシウムとウイルス複製能との関連を詳細に調べる予定である。またNSP4変異ウイルスを作製する過程で、NSP4のN末端領域に2か所あるグリコシル化部位、N8とN18にそれぞれ変異を加えたウイルスが得られ、単独でのグリコシル化が阻害されたウイルスが得られた。NSP4のグリコシル化部位は全てのロタウイルス株で保存されているが、その機能は不明である。今後はN8、N18を同時に改変したウイルス株を作製し、ウイルス増殖能及び病原性への関与を検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度はNSP4変異ウイルスの作製を主に進めたが、ロタウイルス人工合成法の効率が格段に上がったために、予算使用額は予定よりも抑えることが出来た。次年度以降はin vitroにおけるウイルス複製能の分子生物学的解析と、多量のマウス実験を予定しているため、繰り越した予算をこれらに使用する予定である。
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