2018 Fiscal Year Research-status Report
Analyses of the antiviral spectrum of the novel host factor MARCH8
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18K07156
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
徳永 研三 国立感染症研究所, 感染病理部, 主任研究官 (50342895)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | HIV-1 / MARCH8 / ウイルスエンベロープ糖蛋白質 / シュードウイルス / 抗ウイルス活性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々が先ごろ報告した新規抗ウイルス宿主膜タンパク質MARCH8が、種々のエンベロープウイルスに対して、どの程度まで広範囲に抗ウイルス活性を示すかを検討した。レンチウイルスに取り込まれることが既知であるウイルスエンベロープ糖タンパク質（Env）のうち、狂犬病ウイルス（RABV）G蛋白質、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）GP蛋白質、3種類のアルファウイルスE2-6K-E1蛋白質、B型肝炎ウイルス（HBV）S蛋白質の発現ベクターを作製した（またA型インフルエンザウイルス（IAV）HA-NA発現ベクターは購入、SARSコロナウイルス（SARS-CoV）S発現ベクターは分与により入手）。これらを用いて、レンチベクターによるシュードウイルス（PV）を作製し、それぞれ既知の標的細胞を使用して感染実験を行ったところ、HBV-S以外全てのEnvのPVで感染性が確認できた。これらのPVをMARCH8発現の有無により作製して上記同様の実験を行った。その結果、RABV-G、LCMV-GP、全てのアルファウイルスE2-6K-E1のPVはMARCH8発現によって感染性が低下し、IAV-HA-NAおよびSARS-CoV-SによるPVはMARCH8によって影響を受けない事が明らかになった。MARCH8感受性を示したEnvのうち、RABV-GとLCMV-GPの細胞質領域に存在するリジン残基がMARCH8のユビキチンリガーゼ活性の標的となる可能性を考え、アルギニン残基に置換した変異体を作製した。これらを用いたPVの感染実験において、アルギニン変異体のRABV-GおよびLCMV-GPはMARCH8耐性となることが分かった。以上の結果より、幅広い種類のEnvがMARCH8の抑制活性に対して感受性を示すこと、RABV-GとLCMV-GPの場合はそれらリジン残基がMARCH8の標的となることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度（2018年度）の研究計画において、フラビウイルスのMARCH8感受性テストのために、日本脳炎ウイルスシュードタイピング実験のシステム樹立を目指し、ほぼ予定通りに5種類のフラビウイルスPrM-E蛋白質発現プラスミドの作製は終了した。また、それらを用いたシングルラウンド感染実験を実施するために、日本脳炎ウイルスのレプリコンプラスミドpCMV-JErep-fullC（PrM-E遺伝子を除く全てのウイルス遺伝子を含む）にレポーター遺伝子としてNanoLucを挿入した日本脳炎ウイルス蛋白質発現プラスミドの作製も完了した。しかしながら、それを用いたトランスフェクションで得られたウイルスでは、PrM-E発現プラスミドの有無に依らず、感染後の標的細胞において強いNanoLuc活性が検出された。最初は、NanoLucを挿入した領域が、細胞外に大量に分泌されるNS1のN末端であったことが原因と考え、挿入位置をC遺伝子のC末端側など何箇所かにおいて試みてみたものの、結果は同様であった。これはコトランスフェクションにより産生された日本脳炎ウイルスにおいて、ウイルス粒子中にエンベロープを取り込んでいない場合でも、標的細胞内にエントリーまたは細胞表面に吸着してしまった可能性があることを示す。この原因は依然として不明であるが、もしかしたらJEVのPrM-E欠損型プラスミドに残骸的に存在する欠損E遺伝子中の69塩基（C末23アミノ酸相当）部分が、細胞表面への非特異的な吸着を招いてしまったのかもしれない。いずれにしても現段階では、日本脳炎ウイルスシュードタイピングのシステム樹立は一旦頓挫しているが、今年度（2019年度）に、一応、前述のE遺伝子部分の残骸配列を取り除いたうえで、再度、NanoLucを挿入したプラスミドの構築を試みる予定にしている。それ以外の研究計画の進捗状況は、おおむね良好であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度（2019年度）以降は、MARCH8とウイルスエンベロープ分子間相互作用または細胞内共局在性解析に注力する。まず前者の実験として、MARCH8と各種ウイルスエンベロープの発現ベクターを293T細胞にコトランスフェクションした後の細胞溶解液を用いて免疫沈降反応を行う。得られた沈降物をウエスタンブロット法に供することにより、MARCH8と各種ウイルスエンベロープの分子間相互作用の有無について検討する。両者で相互作用が認められた場合、上記3の①で作製した変異体またはキメラを用いて免疫沈降を行い、分子間相互作用の有無がウイルス感染性と相関するか否かを検討する。後者の実験では、MARCH8と各種ウイルスエンベロープ発現細胞の画像解析を行う。標記発現細胞を用いた間接蛍光抗体法による画像解析を行い、MARCH8と各種ウイルスエンベロープの細胞内共局在性および細胞内相互作用を検討することにより、それらの結果と免疫沈降および感染実験の結果との相関性について検証する。
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| Causes of Carryover |
理由：年度末納品等にかかる支払いが平成31年4月1日以降となったため。
使用計画：当該支出分については次年度の実支出額に計上予定であるが、平成30年度分についてはほぼ使用済みである。
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