2018 Fiscal Year Research-status Report

閉環状DNAとして染色体外に存在するB型肝炎ウイルスゲノムの維持と分解機序の解明

Research Project

Project/Area Number	18K07160
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Principal Investigator	山本直樹公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主任研究員 (10547780)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	cccDNA / HBV感染感受性細胞
Outline of Annual Research Achievements	B型肝炎ウイルス(HBV)のゲノムは細胞核内において二本鎖閉環状DNA(covalently closed circular DNA; cccDNA)として染色体とは独立して一定量維持される。通常、染色体外DNAの安定性は低いが、逆転写によりウイルスRNAから合成された新規DNAの一部が核に再移行(リサイクル)することで一定量のcccDNAを維持させていると考えられている。一方、HBV標的siRNAを用いてリサイクルに関わるウイルスRNA、コア蛋白質および逆転写酵素を低下させてもcccDNAは大きく減少しなかった。これは、リサイクルを介さずにcccDNA量が維持されていることを示唆している。これまで、インターフェロン応答因子がcccDNA量の低下に関与していることが報告されている。また、代表者が見出した新規抗HBV化合物は、リサイクルの阻害とは異なる機序でcccDNA量の低下を導いていることが示唆されている。そこで本研究は、cccDNA量の維持および分解に関わる機序を解明することを目的とする。 2018年度においては以下の4点について研究を進めた。(1) cccDNA量の維持および分解に関わる宿主因子の解析を効率的に進める為、肝臓に近いヒト肝培養細胞を作製する。(2) cccDNA量の変化を正確に評価する為、高感度で特異的な定量PCR法を確立する。(3) 新規抗HBV化合物の標的宿主因子と作用機序を解析する為、化合物の活性部位を同定する。(4) cccDNA量の低下を導く新たな化合物を探索する。そして、cccDNA量を制御する宿主因子を同定し、その作用機序を解析する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason HBV持続感染肝細胞内において一定量維持されているcccDNA量は、インターフェロン(IFN)誘導性の宿主因子により低下することが報告されている。一方、これまで使用してきたHBV感染感受性HepG2-hNTCP細胞株は親株であるHepG2細胞に比べてIFN応答性が乏しかった。そこで2018年度は、cccDNA量の制御に関与する宿主因子を解析する為、IFN応答性を保持したHepG2-hNTCP細胞株を作製した。感染細胞におけるcccDNAの維持および分解に関わる宿主因子の解析には、高感度で簡便なcccDNA量の評価方法が必要である。これまで、代表者はcccDNA特異的定量PCR法を構築してきた。そこで、2018年度は、サザンブロッティング法を用いてこの定量PCR法の特異性を検証した。新規抗HBV化合物へのタグ付加は、相互作用する宿主因子の探索に有用である。そこで、化合物の活性部位を同定する為、誘導体を合成した。そして、化合物の活性に重要な官能基を同定した。また、これら新規抗HBV化合物とは異なる、cccDNA抑制効果を示す化合物を新たに見出した。
Strategy for Future Research Activity	2019年度以降は、2018年度の研究で新たに見出した化合物を用いて、cccDNA量の維持および分解に関わる宿主因子の同定と作用機序解析を進める。具体的には、肝細胞への化合物投与により発現変動する宿主遺伝子の網羅的解析を進め、候補遺伝子を選択する。HepG2細胞はプラスミドDNAやsiRNAの導入効率が低いことが知られているが、作製したHepG2-hNTCP細胞は外来核酸の導入効率が高かった。そこで、このHepG2-hNTCP細胞において候補遺伝子を過剰発現またはノックダウンすることでcccDNA制御因子を同定する。さらに、正常ヒト肝細胞である初代ヒト肝臓キメラマウス肝培養細胞を用いた検証も試みる。2018年度までの研究で、新規抗HBV化合物の活性に重要な官能基が同定された。そこで、化合物が直接相互作用する宿主因子を探索する為、タグ付加化合物の合成と高活性体取得を目指す。また、cccDNAと相互作用して維持と分解に関わる宿主因子を探索する為、化合物投与により発現変動する宿主遺伝子の網羅的解析も進め、候補遺伝子を選択する。
Causes of Carryover	2018年度は研究計画の優先順位を一部変更し、cccDNA安定性の検討を次年度以降にずらした為、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、cccDNA安定性の検討と共に、これまで得られた結果を基にcccDNAの維持と分解に関わる宿主因子の同定と作用機序解析に使用する予定である。