2020 Fiscal Year Research-status Report
閉環状DNAとして染色体外に存在するB型肝炎ウイルスゲノムの維持と分解機序の解明
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18K07160
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
山本 直樹 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, 主任研究員 (10547780)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | HBV cccDNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
B型肝炎ウイルス(HBV)は肝炎、肝硬変および肝癌の原因ウイルスのひとつである。HBVは乳幼児期に感染すると高い確率で持続感染化する。HBVゲノムDNAは部分的に一本鎖の不完全二本鎖DNA(relaxed circular DNA: rcDNA)でウイルス粒子内に封入されている。一方、感染肝細胞の核内では完全な二本鎖閉環状DNA(covalently closed circular DNA: cccDNA)として染色体とは独立して一定量維持されている。
通常、染色体外DNAは安定性が低いとされている。cccDNAの維持メカニズムとしては、全長ウイルスRNAから逆転写された一部のウイルスDNAが核に再移行することで一定量のcccDNAを維持させる「リサイクル経路」が考えられているが、未だ明らかにされていない。
これまで、逆転写酵素阻害剤やHBV mRNAを標的としたsiRNAを用いてリサイクル経路に関わるウイルスRNA、コア蛋白質および逆転写酵素を阻害してもcccDNAは大きく減少しなかった。これは、リサイクル経路を介さないcccDNA維持機構の存在を示唆している。そこで本研究は、化合物スクリーニングから得られたcccDNA量を減少させる新規抗HBV低分子化合物の作用機序を解析すると共に、cccDNAの維持及び分解機序を解明することを目的とする。
2020年度は以下の2点について研究を進めた。① cccDNAの維持と分解に関わる因子を解析する為に、cccDNA複合体の分離精製法を検討した。② cccDNAに関わる宿主因子に対する新規抗HBV低分子化合物の影響を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究は、新規抗HBV低分子化合物の作用機序を解析すると共に、cccDNAの維持および分解機序を解明することを目的としている。申請者はこれまで、cccDNAの解析を効率的に進める為、HBV cccDNA定量法を構築した。また、HBV感染受容体であるhNTCPの安定発現HepG2細胞を構築すると共に、遺伝子型AとCのHBV安定発現HepG2細胞を構築してきた。一方、新規抗HBV低分子化合物の作用機序解析においては、化合物の活性に関わる官能基を同定し、その性質を明らかにしてきた。
cccDNAは核内において染色体と同様にヒストンを含む宿主蛋白質と複合体を形成したミニクロモゾーム構造で維持されている。そこで2020年度は、密度勾配超遠心法を用いたcccDNA複合体の分離精製法を検討した。その結果、rcDNAとは異なるcccDNAのフラクションの回収に成功した。これにより、cccDNA複合体と直接相互作用する宿主因子の解析を効果的に進めることが出来るようになった。
新規抗HBV低分子化合物の標的宿主因子は不明である。そこで、既に報告があるcccDNAに関わる宿主因子に対する低分子化合物の影響を検討する為、HBV安定発現HepG2細胞に宿主因子の過剰発現プラスミドを導入し、新規抗HBV低分子化合物を投与した。その結果、低分子化合物と宿主因子の相互作用は認められなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
HBVは感染肝細胞核内において一定コピー数のcccDNAが安定的に維持されることで持続感染化する。しかし、cccDNAの維持と分解機序の詳細は未だ明らかにされていない。本研究は、スクリーニングにより得られたcccDNA量を減少させる新規抗HBV低分子化合物の作用機序を解析すると共に、cccDNAの維持及び分解機序を解明することを目的としている。
2020年度までの研究から、低分子化合物の抗HBV活性に関わる官能基の特定とその性質を明らかにしてきた。また、cccDNA制御因子の解析ツールとして外来核酸の導入効率が高いHBV感染感受性HepG2細胞とHBV安定発現細胞を構築してきた。さらに、cccDNA特異的リアルタイムPCR法とcccDNA複合体の分画法を構築した。
2021年度は、新規抗HBV低分子化合物の標的因子を探索する。また、HBV持続感染初代ヒト肝細胞およびHBV安定発現細胞におけるHBVのrcDNA、cccDNAおよびRNAを解析することで、ウイルスライフサイクルにおける低分子化合物の作用点とその機序を解明する。さらに、HBV持続感染初代ヒト肝細胞を用いて、異なる遺伝子型のウイルスに対する低分子化合物のcccDNA抑制効果を評価する。
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| Causes of Carryover |
2020年度は新型コロナウイルス感染症の影響で研究遂行に遅延が生じた。2021年度は「今後の研究の推進方策」に従って以下の3点を中心に使用する。① 新規抗HBV低分子化合物の標的因子を探索する。② ウイルスライフサイクルにおける低分子化合物の作用点と機序を解明する。 ③ 異なる遺伝子型のHBVに対する低分子化合物のcccDNA抑制効果を評価する。
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