2019 Fiscal Year Research-status Report
Satb1の複合体形成に関与する新規長鎖非翻訳RNAの同定およびその機能解明
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18K07177
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
市山 健司 大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 特任助教(常勤) (60777960)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 制御性T細胞 / 長鎖非翻訳RNA / Foxp3 / CRISPRi |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和元年度は、Satb1を介した制御性T細胞(Treg)特異的なエピゲノム形成およびTregの分化・増殖機構の分子基盤の確立を目指し、特にSatb1と複合体を形成する転写因子Ikzf1のTregにおける役割を中心に解析を進めた。具体的には、Ikzf1のTregにおける生理的な役割を検討するため、Treg特異的にIkzf1のDominant Negative変異体を発現する遺伝子改変マウスを作製し、Tregの分化・増殖および免疫抑制機能に及ぼす影響について解析を行った。その結果、TregでIkzf1の機能が欠失することでTregの免疫抑制機能に異常が生じることをin vitroの系だけでなく腸炎モデルを用いたin vivoの系でも明らかにした。さらに、Ikzf1の機能欠失Tregは免疫抑制機能の異常だけでなく、転写因子Foxp3の発現維持にも異常が認められ、野生型Tregと比較して顕著にFoxp3の発現を失いやすいことを見出した。
また、Tregの分化および免疫抑制機能に関与する新規長鎖非翻訳RNA(LncRNA)の同定を目的として、前年度樹立した新規遺伝子抑制法であるCRISPRiシステムの詳細な検討も引き続き行なった。具体的には、CRISPRiシステムを用いてこれまでにTh17分化を制御することが報告されている既知のLncRNAであるRmrpを標的にして報告通りの表現系がprimary T細胞において再現できるか検討を行った。方法としては、活性化させたprimary T細胞にウイルス感染によりCRISPRiおよびguideRNAsを導入後、Th17およびTh1条件下で4日間培養した。その結果、Rmrpの発現を抑制することで報告通りTh17分化が有意に抑制された。一方で、Th1分化には影響が認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、Satb1と結合する転写因子Ikzf1の遺伝子改変マウスの解析を進め、Ikzf1の機能を欠失したTregは免疫抑制機能を失うだけでなく、転写因子Foxp3の発現維持も顕著に低下することを新たに明らかにした。しかしながら、primary T細胞においてshRNAによるLncRNAの発現抑制が予想より困難であったことや、発現レベルを指標にして選出したLncRNAの多くがTregの分化および機能に無関係であったため、当初計画していたSatb1の複合体形成に関与する新規LncRNAの同定および欠損マウスの作製まで進むことができなかった。
これらの進捗状況から本研究課題は、やや遅れていると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究推進方策として、転写因子Ikzf1の機能欠損によるTreg機能異常およびFoxp3不安定化の詳細な分子機構を明らかにするため、RNA-Seq法およびChIP-Seq法を用いて網羅的な解析を進める。特に、Ikzf1の機能欠損によりTreg特異的なエピゲノム形成やFoxp3を介した遺伝子発現制御にどのような影響が及ぶのかFoxp3やヒストン修飾(H3K4me3, H3K27me3, H3K27acなど)を標的としたChIP-Seqを行う。さらにはクロマチン状態に及ぼす効果も検討するためATAC-Seqを行う。
また、Tregの分化および免疫抑制機能に関与する新規LncRNAの同定を目的に、今回確立したCRISPRiシステムを用いたスクリーニングを行う。具体的には、発現レベルを指標に標的を選出するのではなく、全LncRNAを対象にしたguideRNAのライブラリーを作製し、Foxp3の発現変化をアウトプットの指標にしてノンバイアスな網羅的スクリーニングを行う。
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| Causes of Carryover |
新型コロナにより非常事態宣言が発令された影響で予定した実験行えなくなり、試薬の購入も出来なくなったために次年度使用額が生じてしまった。
今年度予定していた実験は計画通り実行し、加えて新型コロナにより昨年度末に行うことの出来なかった実験を今年度に繰り越して行うことで次年度使用額を消費する。
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