2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K07179
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
高江洲 義一 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 准教授 (60403995)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松崎 吾朗 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 教授 (30229455)
梅村 正幸 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 准教授 (90359985)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 結核菌 / 感染症 / マクロファージ / 自然免疫 / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
結核菌による宿主免疫の回避機序を分子レベルで明らかにするため、結核菌が産生するエフェクタータンパク質Aに着目してその作用機序の解明に取り組んだ。まず、このタンパク質の宿主側標的分子を同定するために、Aをbaitとしたyeast two-hybrid screeningを行い会合分子を探索した。その結果、Aの新規結合分子として既知のミトコンドリア局在タンパク質を分離した（以後、この分子をEssential Regulator of Inflammation in Mitochondria, ERIMと呼ぶ）。自然免疫応答の制御におけるERIMの役割を明らかにするために、CRISPR/Cas9法を用いてERIM遺伝子を破壊したJ774.1マウスマクロファージ細胞株を２クローン樹立し、これらの細胞におけるIL-1bの産生をELISA法で調べたところ、ERIMはLPS + ATPおよびLPS + Nigericinで誘導されるIL-1bの産生に必須であることが明らかとなった。そこで、IL-1bの遺伝子発現をRT-qPCR法で調べた結果、LPS刺激で誘導されるIL-1bの発現量は、ERIM欠損細胞においてもJ774.1元株と同程度であった。以上のことから、ERIMはIL-1b産生制御において、転写因子NF-kBの活性化を誘導する”Priming”の経路には関与せず、NLRP3インフラマソームの活性化を誘導する”Activation”の経路で必須の役割を果たすことが示唆された。一方で、LPS + Poly dA:dT刺激を与えた場合は、ERIM欠損細胞においても元株と同レベルのIL-1b産生が認められたため、ERIMはAIM2インフラマソームの活性化には関与しないと結論づけた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
結核菌が産生するエフェクター分子の一つで炎症抑制作用を持つAと会合する宿主ミトコンドリアタンパク質(ERIM)を世界で初めて同定した。ERIMタンパク自身は既知の分子であるが、IL-1b産生への関与はこれまで全く報告がない。本研究では、ERIM遺伝子欠損マクロファージ細胞株を独自に樹立し、細胞内在性ERIMがIL-1b産生に必須の役割を果たすことを見出した。ERIMの作用機序として、IL-1bのmRNA発現誘導には全く関係せず、NLRP3インフラマソームの活性化に必須であること、AIM2インフラマソームの活性化には関与しないことまで突き止めた。さらに、ERIMコンディショナルノックアウトマウスを樹立した海外の研究室との間で共同研究を行うことで合意し、当該研究室からERIM-floxマウスを譲り受け、申請者の所属施設で飼育中のCreマウスとの交配を始めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はERIMの作用機序を詳細に明らかにする。ERIMはミトコンドリア局在タンパク質であるため、ERIM欠損細胞におけるミトコンドリア電子伝達系の活性およびATP産生量を元株と比較する。さらに、結核菌エフェクターAを安定発現するJ774.1マクロファージ細胞株を樹立し、Aの単独発現がERIM欠損と同じ効果をもたらすかについて、IL-1bの産生、IL-1bのmRNA発現、NLRP3インフラマソームの活性化、電子伝達系の活性等を指標に検証する。またAのプロテアーゼ活性喪失型変異体を用いて、同様の解析を行う。これらと平行して、ERIMコンディショナルノックアウトマウスから骨髄由来マクロファージ（BMDM）を調製してin vitroでの解析を進める他、BCG感染実験も行い、A-ERIM相互作用が結核菌に対する生体防御応答にどのように寄与するか明らかにする。
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