Study for nuclear functons of Themis in the thymus and periphery.

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07188
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 角川 清和 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 研究員 (80391910)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Themis / T細胞分化 / 胸腺 / 核移行 / 自己免疫疾患

Outline of Annual Research Achievements

T細胞特異的に発現しているThemisの遺伝子座はヒトのセリアック病、アトピー性皮膚炎や潰瘍性大腸炎などの自己免疫疾患との関連が示唆されている。また、Themisノックアウトマウスでは成熟T細胞が激減している。これまで、ThemisタンパクはT細胞受容体シグナル伝達におけるアダプタータンパクとして働くと報告されてきたが、我々は細胞中の約半分のThemisタンパクが核に存在すること、Themisタンパクが細胞質にとどまるように変異を導入したThemis変異体ノックインマウス（R-NLSマウス）では、Themisノックアウトマウスと同様に成熟T細胞数が減少することを明らかにした。これらの結果からThemisが細胞核でも重要な役割を担っていることが明らかとなった。そこでこれまで注目されていなかったThemisの核での働きを明らかにするため質量分析を行いThemisと結合する分子を探索し、一つの転写因子を同定した。この結合は免疫沈降試験でも確認できた。この分子は転写制御分子であるためThemisによる転写制御を調べるため胸腺細胞を用いたCｈIPseq解析を予定している。
また、R-NLSマウスとは逆に核にのみとどまるThemis変異体のノックインマウス（SV40マウス）でもT細胞の分化成熟が阻害されたことよりThemisはT細胞受容体近傍のシグナル伝達に必須であることも確認された。これらの結果から、Themisタンパクは細胞質と核の両方に存在することがその機能に必要であることが示唆される。R-NLSマウスとSV40マウスの交配によってできたマウスでは、片方の遺伝子座から細胞質にとどまるThemisが、他方の遺伝子座から細胞核にとどまるThemisが転写される。このようなマウスの胸腺でもT細胞の分化は明らかに阻害されておりThemisの細胞質-核間移動が重要であることが分かった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

胸腺細胞を核分画と細胞質分画に分離してウエスタンブロッティングを行うことよりThemisタンパクは核と細胞質にほぼ同量存在することが分かった。Themisタンパクは核移行シグナル配列（NLS）を持つためこれを欠損したノックインマウスを作成したが、タンパクが不安定になるためかノックインマウスの胸腺細胞ではThemisタンパクの量が激減していた。これを改善するため、NLSをその相同配列と入れ替えたR-NLSマウスを作成しこの問題を回避した。樹立したマウスの胸腺細胞では予想通り、核は細胞質にとどまり、核分画では検出できなかった。このマウスの解析により細胞核にThemisがないとT細胞の分化が進まないことを明らかにした。このマウスでT細胞の分化が著しく阻害されていた。逆に、Themisが核のみにとどまればどうなるのかを調べるため、SV40のNSLをThemisに付加したノックインマウスを作成し調べた結果、このマウスでも同様に成熟T細胞が減少していた。このマウスの作成・解析により細胞質でのThemisの重要性を再確認した。さらに、これら2つのThemis変異ノックインマウスを掛け合わせたR-NLS/SV40マウスの解析よりThemisの細胞質・核間の移動がその機能に重要であることを示した。現在、細胞質から核への移行をタモキシフェンで制御するためERT2-Themis結合ノックインマウスを樹立する準備を進めている。
Themisの核での働きを明らかにするために行った質量分析によりT細胞特異的転写因子が同定できたため、現在ThemisによるChIP-seqを行うための準備を進めている。このためのｘ３Flag Themisノックインマウスは樹立している。

Strategy for Future Research Activity

Themis ChIP-seqの遂行と解析を行う。また、結合を確認した転写因子についてもThemis存在・非存在下でゲノムへの結合が変化するかどうか調べる。つまり、この転写因子のChIP-seqを野生型マウス並びにThemisノックアウトマウスで行い比較する。ERT2-Themisノックインマウスが樹立できたらまず、Themisが細胞質にとどまることでT細胞の分化が抑制されるか確認したのち、タモキシフェンの投与でこれが解除されるかどうか、末梢血のフローサイトメーター解析で経過観察する。さらに、Themisの核への移行が何によって制御されているのか調べる。Themisと相同性のあるドメインを持つGAREM１が14-3-3によって核移行を制御されているという報告があるため14-3-3が最初の候補になる。
末梢でのThemisの働きに関しては、成熟細胞でのみCREタンパクを発現するdLCK-creトランスジェニックマウスとThemis floxマウスの交配を準備している。樹立できれば腸を含む末梢での分化をフローサイトメーターで調べる。またナイーブT細胞を分離してTh1, Th2, Th17, Treg, CD4CTLへの分化能をしらべる。

Causes of Carryover

予定していたChIP-seqの実験と解析が年度内に間に合わなかったため。
これには磁気ビーズ、抗体、ライブラリ作成キット、ライブラリー定量キット、次世代シークエンサーでの解析にかかる費用が含まれ、令和元年度に必要となる。
作成したノックインマウスの樹立が計画より遅れてたため。