2018 Fiscal Year Research-status Report
ネオSeed & Soil：臓器特異的がん間質でがんの臓器親和性は変えられるか？
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18K07192
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
栗山 正 秋田大学, 医学系研究科, 准教授 (30398226)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | がん間質 / 臓器親和性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん間質の構成要素の一つ、CAF(Cancer Associated Fibroblasts)は腫瘍組織から単離され株化されている。日本では胃がん患者が多く、胃切によって大きく組織を切り取るのでがん間質が回収しやすい。同様に欧米では前立腺がん患者が多いのでがん間質も前立腺がん由来のものが使われている。古くからSeed&Soil説と言われるがんと転移先の関係を予測した学説がある。転移で運ばれるがん細胞（Seed）はある決まった臓器にある土壌（Soil)でのみ育つというものである。我々はがん間質に注目し、がんの臓器親和性が臓器ごとに存在する間質細胞が作る環境によって決められているのではないかと考えた。これまでの研究において特定の臓器に転移しやすくなった高転移株を作成してきた。これらの高転移株を作成する際には腫瘍組織を切り出し、がん細胞株に入れた抗生物質抵抗遺伝子を用いてがん間質や血球細胞など余分な細胞を殺していた。細胞の密度を下げて培養するとがん細胞であればクローニングができるが、正常細胞に近いがん間質細胞は分裂しなくなってがんと分離することは困難になる。そこで抗生物質耐性遺伝子を発現するマウスが居れば腫瘍組織からまるごと間質細胞を回収できると考えた。これにより臓器特異的ながん間質細胞のセットを得る。それぞれのセットの遺伝子発現を比較して臓器特異性に寄与する因子を探索する。それぞれの間質セットと元の株とは異なるがん細胞株とをスワップしてがん間質が臓器親和性に寄与しているかどうかについて明らかにしていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初CAFにターゲットを絞って比較をすることを考えていた。当研究室においてCAFに発現していることを報告したAsporin分子のプロモーターを薬剤耐性遺伝子とつなげて解析しようとしていた。しかしながら我々のラボで使用していた市販品の抗Asporin抗体がなぜかDiscontinuedになってしまった。プロモーター解析を行うために内在性のAsporinを発現する細胞株が必要である。しかしながら現在発売されている他のAsporin抗体はすべて他のタンパク質を認識した。その結果は当研究室で保持しているAsporinのノックアウトマウスで確認した。mRNAが確認された細胞株においてもタンパク質が確認されなかった細胞株などがあり、加えて抗体も確固たるものが得られていないのでAsporinを一旦保留し、TGFBI遺伝子を解析することにした。TGFBI遺伝子はTGF-βに反応して発現し間質細胞に発現していることを確認している。このTGFBI遺伝子の上流３kbを解析し、上流数100bpまでプロモーター領域を絞り込んだ。さらに利用しようと考えていたトランスジェニック作成サービスが使えなくなったため本学の動物施設で作成することになった。しかしまだ実績がなくトランスジェニックを効率よく作成することが難しいようなので全身に薬剤耐性遺伝子を発現するマウスを作成するように計画を一部変更した。
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| Strategy for Future Research Activity |
TGFBIプロモーターと蛍光タンパク・自家切断ドメイン・薬剤耐性遺伝子をつないだコンストラクトを作成した。しかしながら確実にトランスジェニックを作るためにTGFBIプロモーターの前にloxp-CMV-loxpのユニットを挟み、全身に蛍光タンパクと薬剤耐性遺伝子を発現するマウスを作ることにした。後で全身にCre recombinaseを発現するマウスと交配するとTGFBI制御下に発現するマウスに改変することができる。このマウスを用いてがん間質のセットを回収し、遺伝子発現量を間質全体で捉え比較する。個々の分子について免疫組織学的に解析し、どの間質細胞がどの遺伝子を発現しているかを解析する。また間質セットとがん細胞株をスワップ（入れ替えて）移植し、特定臓器由来のがんが別の臓器由来の間質によってその行き先を変更できるかについて明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
予備実験で使っていた抗体が販売中止になってしまったため代替の抗体を探したがどの抗体も本当の標的を認識しないという予想外の結果になった。その結果プロモーター解析に適したシステムを失う事になってしまった。プロモーターの解析は進んでいたがウェスタンブロットの解析結果と齟齬があり、それを埋めるツールがなくなったのでAsporinのプロモーター(CAF特異的）は断念した。そこでTGFBIという他のターゲットの解析を始めたので当初予定していたトランスジェニックマウス作成のサービスを使えなくなってしまった。その後新たにCAFプロモーターを単離してコンストラクトを作成はしたが、TGFBIのembryonicな発現がわからないのでUniformなプロモーターをTGFBIプロモーターの前に挟む事にした。これによりトランスジェニックラインの選別が捗る事が期待できる。本学動物実験施設において作成にかかる費用として使用する。
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[Journal Article] Curucumin analog, GO-Y078, overcomes resistance to tumor angiogenesis inhibitors2018
Author(s)
Shimazu K, Inoue M, Sugiyama S, Fukuda K, Yoshida T, Taguchi D, Uehara Y, Kuriyama S, Tanaka M, Miura M, Nanjo H, Iwabuchi Y, Shibata H.
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Journal Title
Cancer Sci.
Volume: 109(10)
Pages: 3285-3293
DOI
Peer Reviewed
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