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2018 Fiscal Year Research-status Report

Comprehensive analysis of p53 negative regulation by novel oncogene GRWD1

Research Project

Project/Area Number 18K07201
Research InstitutionKyushu University

Principal Investigator

杉本 のぞみ  九州大学, 薬学研究院, 助教 (00633108)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
KeywordsGRWD1 / RPS17 / RPL22 / p53 / p21 / MDM2
Outline of Annual Research Achievements

GRWD1 (glutamate-rich WD40 repeat containing 1) はがん抑制性リボソーム因子RPL11、あるいはRPL23と結合して機能を抑制し、その結果、腫瘍抑制因子p53を抑制し、がん遺伝子として機能する。本研究は、質量分析法によってGRWD1結合が同定されたRPS17およびRPL22に着目している。RPS17およびRPL22はがん抑制性に関与している可能性があるが、その実態は不明である。本研究は、①それらとGRWD1結合の意義やがん抑制活性を持つのかなどを明らかにし、さらには ②GRWD1が直接p53の転写活性化能を制御する可能性についても明らかにすることを目的としている。
①については、in vitro多段階発がんモデル (HFF2/T/E7/KRAS細胞) において、RPS17あるいはRPL22を発現抑制したところ、RPS17の発現抑制によって大型のコロニー形成が認められた。一方、RPL22の発現抑制ではそのような結果は得られなかった。この結果は、RPS17ががん抑制活性を持つ可能性を示唆している。次に、同細胞をsiRNAで処理し、その後アクチノマイシンD処理によって核小体ストレスを与え、p53とその下流因子であるp21の誘導量を調査した。その結果、RPS17の発現抑制によりp53およびp21が過剰誘導された。つまり、RPS17はp53およびp21非依存的にがん抑制活性を示すことが示唆された。RPS17のがん抑制活性のメカニズムを明らかにするため、結合因子の同定を行った。現在は、同定されたRPS17結合因子候補とRPS17との結合の意義を調査しているところである。
②については、GRWD1はp53と直接結合することでp53の転写活性化能を抑制し、発がんを促進することが示唆された。この内容については論文投稿中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①RPS17のがん抑制活性の検討:RPS17を発現抑制させたHFF2/T/E7/KRAS細胞を軟寒天コロニー形成試験に供した結果から、RPS17はがん抑制活性を持つことが示唆された。別のリボソーム因子RPL11はMDM2の機能抑制を介してp53量を正に制御することでがん抑制的に働く。RPS17についても同様なのかを調べるため、免疫沈降を行ったところ、わずかながらRPS17とMDM2との細胞内結合が認められた。一方、核小体ストレス時に誘導されるp53の安定化は、RPL11の発現抑制によって阻害されたが、RPS17の発現抑制では阻害されなかった。これらの結果から、RPS17はRPL11とは異なり、MDM2-p53経路非依存的ながん抑制活性を有することが示唆された。RPS17によるがん抑制活性の実態を探るため、RPS17に結合する因子を質量分析法により同定し、複数の興味深い因子が同定された。それらの因子との関連については次年度調査する予定である。
②RPL22のがん抑制活性の検討:RPL22を発現抑制させたHFF2/T/E7/KRAS細胞を軟寒天コロニー形成試験に供したところ、大型のコロニー形成は認められなかった。一方、RPL22の発現抑制によってRbレベルが低下した。代表的な細胞がん化の経路としては、p53経路のほか、Rb経路が挙げられる。そこで次年度以降は、Rb経路にRPL22が関与する可能性を調査することで、RPL22もがん抑制活性を有するのかを明らかにしたい。
③GRWD1によるp53転写活性化能の抑制の検討:GRWD1はp53標的遺伝子のプロモーター上で直接p53と結合することでその転写活性化能を抑制することが示された。本内容は、現在学術雑誌に投稿中である。

Strategy for Future Research Activity

①RPS17のがん抑制活性の検討:結合因子のうち、がん抑制に関わることが報告されている因子との関わりを調査する。まずは物理的相互作用を調査する。その後、RPS17の発現抑制、あるいは過剰発現が当該因子のレベルや細胞内局在などに与える影響を調査する。さらに、当該因子との結合部位を欠損したRPS17はがん抑制活性が失われるのかを調べるため、in vitro多段階発がんモデルを利用し、軟寒天コロニー形成試験およびヌードマウスにおける腫瘍形成試験を行う。
②RPL22のがん抑制活性の検討:ここまでに利用してきたin vitro多段階発がんモデル (HFF2/T/E7/KRAS細胞) を一部改変し、HFF2/T/E6/KRAS細胞に対してRPL22の発現抑制を行い、軟寒天コロニー形成試験を行うことで、RPL22がRb経路に関わることでがん抑制活性を持つのかを調査する。これが達成されたのち、RPS17と同様、RPL22結合因子の網羅的同定を行い、がん抑制活性のメカニズムを明らかにする。

  • Research Products

    (12 results)

All 2019 2018

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (10 results) (of which Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Inhibiting the MCM8-9 complex selectively sensitizes cancer cells to cisplatin and olaparib.2019

    • Author(s)
      Morii, I., Iwabuchi, Y., Mori, S., Suekuni, M., Natsume, T., Yoshida, K., Sugimoto, N., Kanemaki, MT. and Fujita, M.
    • Journal Title

      Cancer Science

      Volume: 110 Pages: 1044, 1053

    • DOI

      10.1111/cas.13941.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Glutamate-rich WD40 repeat containing 1 regulates ribosomal protein L23 levels via the ubiquitin-proteasome system.2018

    • Author(s)
      Watanabe, S., Fujiyama, H., Takafuji, T., Kayama, K., Matsumoto, M., Nakayama, KI., Yoshida, K., Sugimoto, N. (Corresponding author), and Fujita, M.
    • Journal Title

      Journal of Cell Science

      Volume: 131 Pages: -

    • DOI

      10.1242/jcs.213009.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Molecular mechanisms by which GRWD1 down regulates p53 to transform cells.2018

    • Author(s)
      杉本のぞみ
    • Organizer
      第77回日本癌学会学術総会
  • [Presentation] Inhibiting the MCM8-9 selectively sensitizes cancer cells to DNA-crosslinking agent and PARP inhibitor.2018

    • Author(s)
      岩渕有希子
    • Organizer
      第77回日本癌学会学術総会
  • [Presentation] GRWD1によるp53転写活性化能の制御機構の解明.2018

    • Author(s)
      藤山拓巳
    • Organizer
      第35回日本薬学会九州支部大会
  • [Presentation] TRF2-ORC結合およびテロメア内複製開始点の重要性の解析.2018

    • Author(s)
      比嘉允宜
    • Organizer
      第35回日本薬学会九州支部大会
  • [Presentation] リボソームタンパク質による細胞がん化制御機構の包括的解明.2018

    • Author(s)
      高藤拓哉
    • Organizer
      第35回日本薬学会九州支部大会
  • [Presentation] リピート配列におけるDNA-タンパク質複合体がヒト染色体上で誘導する複製ストレス応答の解析.2018

    • Author(s)
      吉田和真
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会ワークショップ
    • Invited
  • [Presentation] Cdt1結合性クロマチン制御因子によるクロマチン構造変換メカニズムの解明.2018

    • Author(s)
      岩村拓人
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] 高発がん性リボソーム病関連タンパク質RPS19によるがん抑制機構の解明.2018

    • Author(s)
      奥山由桂
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] ヒト染色体上の”複製が困難な領域”における複製フォーク異常停止によって誘導されるDNA損傷応答と染色体異常のIac0-LacIシステムを利用した解析.2018

    • Author(s)
      石本理子
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] がん選択的分裂期停止作用を持つ新規化合物NP-10の作用機序.2018

    • Author(s)
      横山拓哉
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会

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Published: 2019-12-27  

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