SrcによるmicroRNAのエクソソーム内包メカニズムの解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07221
• Research Institution: Aichi Cancer Center Research Institute
• Principal Investigator: 内藤 陽子 愛知県がんセンター(研究所), 腫瘍制御学分野, 研究員 (10553026)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Src / エクソソーム / microRNA

Outline of Annual Research Achievements

本課題は、がん化に伴って特定のmicroRNAがエクソソームに選択的に内包されるメカニズムの解明を目的とする。そのために、様々な種類のがんにおいて発現亢進や異常活性化が知られるがん原遺伝子産物Srcによるがん形質獲得モデル細胞系を用いて解析を行っている。RNAseqによる予備実験から選定した、Src活性化により選択的にエクソソームに内包される可能性のあるmiRNA（Src-EXO miR）について、実際に細胞内発現量によらずエクソソーム内包量が変動することをRT-qPCRにより確認した。これらのmiRNAのうち、胃がんや転移性前立腺がん患者の血中で発現が高いことや、機能的にも大腸がん、乳がん、肝がんなどで腫瘍促進的作用について報告があるmicroRNA（miR-A）に注目して、その結合タンパク質探索をmiRNAプルダウン/質量分析により解析し、miR-A結合タンパク質候補を同定した。これらの中から、RNA結合能など既知の報告と照らし合わせて内包化因子候補を選定した。そして、まずタグを付加したこれらの因子の発現細胞を作成し、実際にmiR-Aとの結合が見られるかをmiRプルダウンにより確認した。これにより、結合が確認された内包化因子候補について遺伝子ノックアウト細胞を作成し、それらの細胞由来エクソソームのmiR-A内包量がコントロールと比較して変動しているかどうかをRT-qPCRにより調べている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の予定では、初年度にmiR-Aのエクソソーム内包化因子の同定までは行っておきたいところであったが、これまでに選定した候補について現在検討途中であり、内包化因子を未同定であるため。

Strategy for Future Research Activity

今後はまず未検討の候補因子についてもエクソソーム内包化の作用を調べ、内包化因子の同定を急ぐ。また、miR-Aとは別のSrc-EXO miR（miR-B）についても結合因子の探索を行っている。miR-Bの結合因子についてはエクソソーム内タンパク質を用いたプルダウンを行うことで、内包後にも結合しているものの同定を目指す。内包化因子が選定された後は、それらがSrc制御下において機能するかを検討し、Srcがどの様に内包化因子の選択的エクソソーム内包機能を制御しているかを当初の計画の通り調べる。

Causes of Carryover

本課題では、内包化されるmiRNAの結合因子を探索することより、エクソソーム内包化因子を選定しようとするものである。そのためにはmiR結合物であるプルダウン産物の質量分析解析を行う必要がある。初年度には注目する内包化miRNA（Src-EXO miR）のうち一つ（miR-A）について、プルダウン/質量分析解析を行ったが、もう一つ(miR-B)は条件検討を行い質量分析解析までには至らなかった。繰り越し分はこのために計上していた分が大半である。これについては２年度に行う予定であるので、次年度使用として使用したい。