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2018 Fiscal Year Research-status Report

Study of the mechanism underlying secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI)-induced malignancy of cancer

Research Project

Project/Area Number 18K07226
Research InstitutionNiigata University

Principal Investigator

三上 剛和  新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80434075)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 上原 範久  九州大学, 歯学研究院, 助教 (30368211)
早津 学  新潟大学, 医歯学系, 助教 (40468898)
水谷 祐輔  新潟大学, 医歯学系, 助教 (40646238)
津田 啓方  日本大学, 歯学部, 准教授 (60325470)
福島 敦史  国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (80415281)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
KeywordsSLPI / がん悪性化 / 細胞移動能
Outline of Annual Research Achievements

Secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI)は、炎症反応の際に白血球が生産する過剰なプロテアーゼから正常な皮膚や粘膜を保護する役割を担うプロテアーゼ阻害因子として知られている。近年、このSLPIが肺がんや大腸がんをはじめ、様々ながん細胞に発現し、その悪性化を誘導する一因となっている可能性が示唆されている。がんの悪性化は、それを構成するがん細胞の増殖能や移動能に大きく依存する。そこで、SLPIを強く発現するヒト口腔上皮癌由来のCa9-22細胞とSLPI遺伝子を欠損させた(ΔSLPI)Ca9-22細胞について、その増殖能および移動能を比較するとともに、網羅的な遺伝子発現解析を行い、SLPI制御下にある関連因子の同定を試みた。Ca9-22細胞と比較して、ΔSLPI Ca9-22細胞では細胞増殖能には大きな違いは認められなかったが、顕著な移動能の低下が認められた。また、マイクロアレイデータをもとにしたバイオインフォマティクスやウエスタンブロット法によるタンパク質のリン酸化レベルの解析などから、Ca9-22細胞では、がん悪性化に関与することが知られているMAPK signaling pathwayが活性化し、転写抑制因子SNAI2の発現が強く誘導されていることが明らかになった。さらに、ChIPアッセイおよびリアルタイムPCR法による解析から、Ca9-22細胞においてSNAI2が細胞接着因子E-Cadherinをコードする遺伝子のプロモーター領域に結合し、その転写を抑制していることが示唆された。これらの結果から、SLPIがMAPK signaling pathwayおよびSNAI2を介してE-Cadherinの発現を抑制し、これによって細胞間の接着が弛緩することで、がん細胞の移動能が亢進すると考えられる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の初年度の研究計画は、①Ca9-22 細胞とΔSLPI Ca9-22 細胞についてマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析を行い,遺伝子発現パターンを比較する。②発現量変化の著しい因子をリストアップし,既存のデータベース上の遺伝子機能情報を参考に細胞移動能・浸潤能,血管様構造の形成等に関与する可能性が高い因子を絞り込む。③候補因子についてはリアルタイムPCR法およびウエスタンブロット法を用いて発現量の変動をmRNAおよびタンパク質レベルで確認する。④解析サンプル数を増やし,より信頼度の高いデータの抽出を試みる。
計画していた全ての解析を行っており、いくつかの重要な役割を担う因子を同定している。したがって、本研究はおおむね順調に進展していると判断している。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究から,細胞移動能制御因子であるLymphocyte cytosolic protein 1(LCP1)の発現がCa9-22細胞と比較してΔSLPI Ca9-22細胞において顕著に減少していることが示された。さらに,KEGG pathway 解析から,ΔSLPI Ca9-22細胞では,cAMPシグナル伝達経路に含まれる45の遺伝子の発現量も減少していることが示された。cAMPシグナル経路の活性化は,Glioma-associated oncogene family zinc finger (GLI) というタンパク質をリン酸化すること,リン酸化されたGLIはLCP1の発現を誘導すること,そしてLCP1は細胞移動能を亢進することが報告されている。したがって,SLPI作用機序の1つとして,SLPIがcAMPシグナル伝達経路に含まれる遺伝子の発現を増加させることによってcAMP シグナル伝達経路が活性化し,これが引き金となってGLIのリン酸化,LCP1の発現誘導がおこり,細胞移動能が亢進される可能性が考えられる。次年度以降の研究では、これらについて解析を行う。
また、同定された候補因子について強制発現や遺伝子ターゲッティング,siRNAなどによる発現抑制を行い,細胞移動能・浸潤能などの特性や,細胞形態に対する影響を検討する。細胞移動能・浸潤能についてはスクラッチアッセイおよび生体組織を用いた三次元培養法14をそれぞれ用いる(in vitro 解析)。これらの実験から,候補因子をさらに絞り込み,その過剰発現あるいは発現抑制細胞をマウスあるいはラットへ移植し,がん形成,組織浸潤,血管様構造の形成,転移等に対する影響について検討する(in vivo 解析)。さらに,各種高解像度顕微鏡を用いて細胞微細構造について観察を行い,細胞形態変化について検討する。

Causes of Carryover

研究成果報告(論文発表)が次年度になったため、再投稿の際の追加実験に必要な費用、投稿料、英文校正のための費用などが、次年度へ繰り越された。

  • Research Products

    (2 results)

All 2018

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (1 results)

  • [Journal Article] Dual effect of polyphosphate on mineralization of rat osteoblast ROS17/2.8 cells in a dose-dependent manner2018

    • Author(s)
      Mikami Y, Omagari D, Mizutani Y, Hayatsu M, Ushiki T, Tsuda H
    • Journal Title

      Journal of Pharmacological Sciences

      Volume: 138 Pages: 209-213

    • DOI

      doi: 10.1016/j.jphs.2018.10.002

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] イオン伝導顕微鏡による細胞・組織イメージング2018

    • Author(s)
      水谷 祐輔、早津 学、三上 剛和、牛木 辰男
    • Organizer
      第124回日本解剖学会総会・全国学術集会

URL: 

Published: 2019-12-27  

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