2018 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of novel CUL3 complex-mediated angiogenesis regulatory pathway
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18K07234
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
坂上 倫久 愛媛大学, 医学系研究科, 助教(特定教員) (20709266)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | CUL3 / 血管新生 / アクチン骨格 / 血管内皮細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血管新生を制御することは、がんや心疾患治療、iPS細胞を用いた臓器再生医療において重要である。しかしながら、その分子メカニズムは未だ明らかではない。本研究計画では、我々が最近同定した新規血管新生制御分子CUL3複合体について、その血管新生制御機構における生理的役割について明らかにする。そこで本年度では、新規CUL3複合体が分解する細胞骨格制御タンパク質の同定を試みた。コムギ無細胞タンパク質合成システムにより、CUL3複合体タンパク質および予想される結合パートナー分子をin vitroで合成し、AlphaScreen assayシステム系を立ち上げた。本系をベースとしたスクリーニング実験の結果、アクチン骨格制御に関わるタンパク質数種類を同定した。これらの分子が実際に血管新生制御において重要な役割を果たすことを確認するために、アクチン重合-脱重合を可視化できる蛍光プローブを発現する血管内皮細胞を用いてノックダウン法によりその詳細な表現型解析を実施した。これらの中から、アクチン重合に関わる新たな血管新生制御因子候補を絞ることに成功した。同定した因子を含めた新規CUL3複合体の機能をin vivoで解析するため、血管内皮細胞特異的コンディショナルノックアウトマウスについては現在作成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画していたスクリーニングが予定通り期間内に終了し、その中から既にポジティブな分子を同定することに成功しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
同定したタンパク質の機能を調べるために、ノックダウン法のみならずレンチウィルスを用いた過剰発現系により表現型解析を実施する。また内在的な分子相互作用については免疫沈降法により確認する。In vivo解析では、コンディショナルノックアウトマウスが作成でき次第、マウス網膜血管新生をモデルに、血管新生における機能的役割を明らかにする予定としている。
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| Causes of Carryover |
血管内皮細胞特異的コンディショナルノックアウトマウスの作成準備に少々時間を要したためであり、その予算については、次年度のマウス作成予算として計上する予定にしている。
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