腫瘍環境の鉄およびROS代謝のリプログラミングにおけるABCB10の役割

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07239
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 山本 雅達 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (40404537)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Ros

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではABCB10の発現変化により生じる細胞内の鉄の蓄積によって、フェントン反応が亢進するメカニズムを検討し、ABCB10の発現変化が鉄代謝のリプログラミングの制御にどのように関わるかを解明することを目的としている。また鉄、PPIXやROSは腫瘍細胞の生存や薬剤感受性、または腫瘍のさらなる悪性化に関連する因子であり、これらを制御することが腫瘍特異的な治療薬の開発につながる可能性が期待されるが、その動態や代謝機構は不明な点が多く、これらを標的とした特異的な治療法は確立されていないのが現状である。このことからまず、マウスメラノーマ細胞におけるAbcb10の発現変化が、腫瘍の増殖や様々な抗がん剤の感受性にどのような影響を及ぼすかを以下の研究方法に従って検討した。
（研究方法）
マウスメラノーマ（B16）のドキシサイクリン誘導性（DOX）のAbcb10発現抑制株(B10KD)を作製し、デキサメタゾン（DEX）、カンプトテシン（CPT）、パクリタキセル（PTX）など作用機序の異なる各種抗がん剤に対する感受性の変化を検討する。細胞毒性についてはMTTアッセイを行なう。またABCB10の発現変化が腫瘍の増殖や悪性化にどのように影響するかを検討するためにマウスに移植して腫瘍径の変化や転移の有無を調べる。細胞増殖についてはBrdUの取り込み、細胞死については活性型Caspase-3の免疫染色などによって評価する。その他ROS、ヘムやPPIXの定量的な解析を行なう。関連するシグナル因子の発現変化はリアルタイムPCRやウェスタンブロット法によって比較検討する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

B10KDはDOX誘導時にB16に対して10パーセント程度のAbcb10の発現を認めた。このB10KD株を用いてAbcb10の発現変化による抗がん剤感受性がどのように変化するかを検討することを目的としてB16とB10KD株についてDEX、CPTやPTXに48および72時間暴露した際の細胞生存率を比較した。
DEXはSmac/Diabloを介してXIAPを抑制することでアポトーシスを亢進する。またミトコンドリア膜電位の上昇をきたしRosを産生する。B10KDではAbcb10発現抑制することで細胞内Rosの蓄積を誘導し、DEX誘導性のRosの産生をさらに亢進することで細胞毒性が増感することを期待したが、B16とB10KD間で細胞毒性の感受性に変化は認められなかった。また、CPTはトポイソメラーゼIを阻害することでDNA複製を阻害し、P53依存性にアポトーシスを誘導する。P53はHeme依存性に分解されることが知られており、B10KDではHemeの合成不全からP53の安定性が増加し、アポトーシスが亢進することを予想したが、B16とB10KD間で細胞死に変化はなかった。一方PTXは微小管の脱重合阻害によりJNK依存性（P53非依存性）にアポトーシスを誘導する。JNK活性化によるアポトーシスはRosによっても活性化することが知られており、B10KDにおいてRosが産生されることでPTXの細胞毒性が亢進することを期待したが、B16とB10KD間で細胞の生存率に変化はなかった。
Hemeを含む血清の存在下・非存在下に加えてHemeとPPIXの前駆体である5Alaを添加することでB16ではHemeの産生によるRosの消化とB10KDではPPIXの産生によるRosの蓄積を促すことで薬剤感受性が増感することを期待したが、これについてもAbcb10の発現に依存した薬剤感受性の変化は見られなかった。

Strategy for Future Research Activity

当研究室において先行して行なったB16とB10KD株のマウス移植実験ではB16に対してB10KDは腫瘍縮小を示した。B16はP53野生型であることから、このB10KDが縮小したメカニズムを理解するために作用機序の異なるアポトーシス誘導性の抗がん剤を用いて細胞毒性試験を行なったがB10KDが縮小する有効な手掛かりを得られなかった。一方、腫瘍細胞内のRosを直接増加させる鉄剤(ホロトランスフェリン)やアルテミシミン(抗マラリア薬)などを用いた細胞毒性試験をB16とB10KD間で比較した検証を未だ行なえていない。これに付随してin vitroやin vivoにおけるRosの測定を行なうことでAbcb10欠損によるRosの産生と代謝、あるいは感受性がどのように変化するかを明らかにできると考えている。またRos応答性の遺伝子発現変化とAbcb10の発現にどのように相関するかの検討が行えていない。これらの検証を重ねることでABCB10の発現変化により生じる細胞内のRosや鉄の蓄積によって、これらの代謝のリプログラミングが生じる可能性を示し、Ros代謝の制御によるがん治療法の開発へ繋がる研究成果を得ることができると考えている。

Causes of Carryover

物品購入時の消費税による千円以下の端数の累積で少額の次年度使用が発生した。2019年度の分ピン購入に充てる予定。