2020 Fiscal Year Research-status Report
Construction of tumor-development mice model using Abcb10 knock out mice exhibiting PPIX accumulation
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18K07239
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
山本 雅達 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (40404537)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Ros / TIC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではABCB10の発現変化により生じる細胞内の鉄の蓄積によって、フェントン反応が亢進するメカニズムを検討し、ABCB10の発現変化が鉄代謝のリプログラミングの制御にどのように関わるかを解明することを目的としている。また鉄、PPIXやROSは腫瘍細胞の生存や薬剤感受性、または腫瘍のさらなる悪性化に関連する因子であり、これらを制御することが腫瘍特異的な治療薬の開発につながる可能性が期待されるが、その動態や代謝機構は不明な点が多く、これらを標的とした特異的な治療法は確立されていないのが現状である。このことから、マウスメラノーマ細胞（B16）やマウス肺がん細胞(LLC)におけるAbcb10の発現変化が、腫瘍の増殖や様々な抗がん剤の感受性にどのような影響を及ぼすか、そのメカニズムを明らかにすることを目的としている。
また、スフェアを形成する細胞から得られる未分化なTIC(tumor-initiating cells)において、ABCB10に加えて鉄の酸化応答に関与する遺伝子群やROSを消化するFeSクラスター合成に関与する遺伝子の発現変化が未分化なTICと通常細胞との間で鉄およびROSの代謝のリプログラミングに関与していることが内外の研究により示唆されているが、ABCB10の発現がどのように関与しているかは明らかにされていない。このことから本研究ではTIC-通常細胞間で鉄やROSの代謝リプログラミングにおけるABCB10の役割を明らかにすることを目的とする。
昨年に続き、マウスメラノーマ（B16）のドキシサイクリン誘導性（DOX）のAbcb10発現抑制株(B10KD)に加えてLewiss 肺がん細胞株（LLC）及びそのDOX誘導性Abcb10発現抑制株（LB10KD）について、接着培養時とスフェア形成時におけるHemeの合成や鉄やROSの代謝に関連する遺伝子の発現変化を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は昨年に引き続き、マウスメラノーマ細胞B16やB10KDに加えてLewiss肺がん細胞株LLC及びLB10KDについて、接着培養時とスフェア形成時におけるHemeの合成や鉄やROSの代謝に関連する遺伝子の発現変化を検討した。
通常培養時にはAbcb10が発現低下するB10KDおよびLB10KDでは野生型B16やLLCに比較してポルフィリン誘導体をミトコンドリア膜間スペースに能動輸送するAbcb6の発現が補完的に上昇していたが、スフェア形成時においてはAbcb10が発現低下するB10KDおよびLB10KDにおいて著名なAbcb6の発現減少が観察された。
同様に、その変動に程度の差は認められるものの、ミトコンドリアに鉄を輸送するMfrn1やFe-Sクラスターを形成し細胞内Rosの消化に働くEpas1、Ireb1、Aco1の発現も減少していた。
このことから、通常培養時においてはAbcb10が発現低下することでHeme合成系に関与する遺伝子群の発現が補完的に上昇し、またRos消化に機能する遺伝子群も発現が上昇するが、スフェア形成時においてはそれらの遺伝子の発現はいずれも減少傾向を示した。
このことから通常培養とスフェアを形成する細胞では、鉄およびRos代謝に関する遺伝子発現のリモデリングが存在し、それはAbcb10の発現変化によって変動することが示唆された。
スフェア形成時のRosや鉄の蓄積を定量化する必要がある事から本年度にこれらの解析系を構築する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Heme合成最終段階にある鉄とPPIXの結合を触媒するFechはP53野生型であるB16やB10KDまたヒト乳がん細胞株MCF7のスフェア細胞で6-8倍と非常に高い発現を示した。逆にP53変異型であるLLCはスフェア形成時にFechの発現が減じており、LB10KDにおいても同様の傾向が観察された。
このことから、通常培養からスフェア形成時に鉄およびRosの代謝遺伝子の発現はAbcb10の発現に依存してリモデリングするものと、Fechのようにスフェア形成時にはAbcb10の発現に逆相関する遺伝子(通常培養時にはAbcb10の発現減少によってFechは亢進する)が存在することが示唆された。
フェロトーシス経路のキーとなるFe-Sクラスターを構成する遺伝子の発現はP53に依存した経路が内外の報告から明らかにされており、同様に本実験においても、Epas1、Ireb1やAco1の発現はLB10KDのスフェア形成時により顕著な減少を示した。
このことからヒト肺がん細胞のA549（P53野生型）やH2030細胞（P53変異型）についてもABCB10発現抑制株を作製し、フェロトーシス感受性や接着培養時とスフェア形成時における鉄やROSの代謝に関連する遺伝子の発現変化についても検討する。
これらの検証を重ねることでABCB10の発現変化により生じる細胞内のRosや鉄の蓄積によって、これらの代謝のリプログラミングが生じる可能性を示し、Ros代謝の制御によるがん治療法の開発へ繋がる研究成果を得ることができると考えている。
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| Causes of Carryover |
研究の進行状況に合わせて予算を執行したため。
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