2019 Fiscal Year Research-status Report

初期がん段階での根治を目指したがん免疫始動システムの解析

Research Project

Project/Area Number	18K07258
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	梶田美穂子東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 日本学術振興会特別研究員 (00607442)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	乳がん / オルガノイド
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、がん免疫の始動システムを詳細に解析し、免疫細胞による初期がんもしくは前がん細胞の排除システムを強化することを目指している。そのため、乳がんをモデルシステムとして、以下のアプローチにより研究を進めている。１変異導入オルガノイドの作製とそれに対する免疫反応の解析まずPIK3CA H1047R, Kras G12D, がん抑制遺伝子p53のドミナントネガティブ変異体p53-DD等を強制発現させた変異オルガノイドを作成した。この変異オルガノイドを野生型メスマウスのmammary fat pad に移植して4－8日後に自然免疫系細胞やT細胞の集積・活性化状態をFACSや組織免疫染色で解析している。この実験により、変異オルガノイドに対する各種免疫反応を比較し、効率的に変異細胞を排除できる免疫反応を同定する。２がん免疫始動システムの可視化への挑戦「１」ではがんになる以前の変異細胞の段階での免疫反応を多角的に解析するが、免疫反応の開始を可視化するために、組織常在性マクロファージに着目した。乳腺の組織常在性マクロファージはCX3CR1+であることが報告されており、CX3CR1-GFP gfp/+ マウスから乳腺オルガノイドを作成すると、乳腺上皮組織に張り付いた状態でGFP＋の組織常在性マクロファージを得ることができる。さらに乳腺オルガノイドと組織常在性マクロファージは１週間以上共培養することができる。このシステムを利用して、変異細胞と組織常在性マクロファージとの相互作用が存在するかを明らかにし、発がんの初期段階でどのようにがん免疫が始動するかを明らかにしていく。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason まずがん免疫始動システムの可視化のため、乳腺オルガノイドにレンチウイルスでがん遺伝子等を導入するが、組織常在性マクロファージを維持したままウイルスによって遺伝子導入した例が他になく、改善を重ねる必要があり、システムの構築に時間がかかった。また、乳腺オルガノイドを撮影するタイムラプス顕微鏡が頻繁に故障し、そのメンテナンスに時間がかかり、実験も何度もキャンセルとなった。以上の理由のため、当初の予定より遅れているが、レンチウイルスのシステムは確立した。また、ウイルス感染を介さずに変異細胞と組織常在性マクロファージとの相互作用の可視化が可能になるLgr5-creERT2: LSL-tomato: APCfl/fl:CX3CR1-GFP マウスの作製も完了し、タイムラプスや免疫染色で解析を始めている。変異オルガノイドを乳腺に移植する系でも興味深い結果が出始めており、今後は研究が発展することが期待できる。
Strategy for Future Research Activity	本年は2019年度の研究を継続するとともに、さらに多様な変異オルガノイドに対する免疫反応を解析するため、Her2、HRas G12V、 p53 R270H、Twistなどを発現する乳腺オルガノイドを作製する。これらの変異細胞に対する免疫反応をFACSや組織染色で解析し、各種変異細胞に対する免疫反応を比較・解析する。またそれらの変異をレンチウイルスシステムを用いてCX3CR1-GFP gfp/+マウスの乳腺オルガノイドに導入し、組織常在性マクロファージと変異細胞との相互作用をタイムラプスや免疫染色などで解析する。以上の研究を通じて、がん免疫の初動を担う免疫細胞の同定、さらにはがん免疫の始動を効率よく誘導する分子メカニズムなどを解明していく。
Causes of Carryover	乳腺オルガノイドを撮影するタイムラプス顕微鏡が頻繁に故障し、そのメンテナンスのため実験が何度もキャンセルとなった。そのため、実験に使用する培地関連試薬などの購入が予定よりも少なくて済んだため、次年度使用額が生じた。繰越分は、本年度の実験においてオルガノイド培養関連試薬やレンチウイルス作製のための試薬等を購入する。