2019 Fiscal Year Research-status Report
Rapid cloning of tumor reactive TCR genes for personalized TCR-T cell therapy
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18K07260
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
浜名 洋 富山大学, 学術研究部医学系, 助教 (90551549)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | TCR / 機能解析 / Luciferase assay / Jurkat / TAP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、がん抗原WT1陽性腫瘍に浸潤したT細胞からWT1反応性のTCR遺伝子を取得することを目的に研究を進めている。
2019年度は、WT1特異的TCRをスクリーニングするための新たなTCR機能解析系の開発を行った。当初の予定では293T-Luc細胞とTCRのIVT mRNAを用いてWT1特異的TCRのスクリーニングを進める予定であったが、293T-Luc細胞にはTCRの発現に必要な多数の遺伝子を導入しており、細胞の継代とともに導入した遺伝子の発現低下がおこり、TCRの抗原反応性の低下が問題となっていた。そこで、2019年度はT細胞由来の細胞株であるJurkat細胞を用いた新たなTCR機能解析系の構築を行った。CRISPR-Cas9システムを用いてJurkatが内在的に発現しているTCR遺伝子をノックアウトし、ヒトCD8α遺伝子を導入した細胞 Jurkat Δαβ hCD8αを作製した。そして、この細胞を用いてTCRの抗原特異性が解析できるかを、NY-ESO-1特異的な1G4 TCR、およびWT1特異的なTAK-1 TCRを用いて検証した。また、当初の予定ではIVT mRNAをTCRの発現に用いる計画であったが、2019年度はTAP (Transcriptionally active PCR) fragmentを用いる方法も検討した。
その結果、（1）エレクトロポレーションによるJurkat Δαβ hCD8αへの遺伝子導入条件の検討をGFP発現ベクターを用いておこない、70～80％の細胞でGFP陽性となる条件を決定し、（2）エレクトロポレーションにより、1G4 TCRおよびTAK-1 TCRのTAP fragmentをJurkat Δαβ hCD8α遺伝子導入し、特異的ペプチド抗原による刺激でLuciferase assay出来ることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本年度は、（1）TCRの機能解析をJurkat Δαβ hCD8αとTAP fragmentを用いたTCR機能解析系に変更したことによる研究の遅延が生じている。また、（2）新しい解析系の能力を評価するため、COS7-WT1-A24（Ub-WT1-ODC cDNAとHLA-A*24:02 cDNAを遺伝子導入）を抗原提示細胞(APC)として、HLA-A*24:02拘束性WT1ペプチド反応性のTAK-1 TCRを発現させたJurkat Δαβ hCD8αを刺激してTCRの反応性が解析できるかどうか検討したが、TCRの反応は検出できなかった。一方、COS7-NYESO1-A24（Ub-NYESO1-ODC cDNAとHLA-A*02:01 cDNAを遺伝子導入）をAPCに用いた場合は、HLA-A*02:01拘束性NY-ESO-1ペプチド反応性の1G4 TCRを発現させたJurkat Δαβ hCD8αにおいて1G4 TCRの活性化が検出された。これらの結果から、WT1のcDNAを用いたWT特異的TCR遺伝子の取得は困難な状況となっている。上記の（1）、（2）の理由により「遅れている」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究結果より、WT1を標的抗原に研究を推進するのは難しいことが予想される。そこで、今後は、NY-ESO-1やネオアンチゲンなどの腫瘍抗原を標的として研究を進めていく。現在、大腸がん患者腫瘍のネオアンチゲン解析を進めており、これまでの研究で構築したJurkat Δαβ hCD8αとTAP fragmentを用いたTCR機能解析系を用いてネオアンチゲン特異的TCR遺伝子の取得を試みる予定である。
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| Causes of Carryover |
研究が遅れており、本年度TCRの機能解析に用いる試薬の購入が見合わせとなり、次年度使用額が生じた。繰り越した研究費については、2020年度に、標的抗原をネオアンチゲンに変更してTCR遺伝子の取得を進める予定であり、その実験に使用する試薬の購入に使用する計画である。
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