2020 Fiscal Year Annual Research Report
Rapid cloning of tumor reactive TCR genes for personalized TCR-T cell therapy
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18K07260
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
浜名 洋 富山大学, 学術研究部医学系, 助教 (90551549)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ネオ抗原 / 腫瘍浸潤リンパ球 / T細胞受容体（TCR) / Jurkat細胞 / Luciferaseアッセイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度はネオ抗原を標的として研究を行った。2019年度に構築したTAP (Transcriptionally active PCR) fragmentとJurkat Δαβ hCD8αを用いたTCR機能解析系を用いて、大腸がんの腫瘍浸潤リンパ球(TIL)由来のTCR遺伝子の中からネオ抗原候補に反応するTCRのスクリーニングを行った。
【方法】
（1）TCR cDNAは、TIL中のPD-1+ CD137+ CD8+ T細胞を単一細胞ソーティングし、RT-PCR法により増幅した。（2）TCRのTAP fragmentは、TCR cDNA断片に遺伝子発現に必要なDNAをGibson assembly法で連結させた後、PCRにより増幅することで作製した。（3）ネオ抗原解析は、腫瘍のDNAおよびRNAのNGS解析により選定した。そして、候補抗原を連結したTMGを作製した。（4）ターゲット細胞（HLA-TMG-MCF7）は、患者HLA発現プラスミドとTMG発現プラスミドを、CRISPR/Cas9でHLA-Class-I をノックアウトしたMCF7細胞へ遺伝子導入して作製した。（5）エフェクター細胞（TCR-Jurkat）は、TCRのTAP fragmentとNFAT-LuciferaseレポータープラスミドをエレクトロポレーションによりJurkatΔαβ hCD8α細胞へ遺伝子導入して作製した。（6）TCRのネオ抗原反応性の解析は、HLA-TMG-MCF7とTCR-Jurkatを一晩共培養後、Luciferaseアッセイにより解析した。
【結果】
これまでに2名の大腸がん患者のTIL得られた33種類と38種類のTCRいついて、ネオ抗原TMG(40と22種類の変異ペプチド)に対する反応性を網羅的に解析した。その結果、2名の患者からネオ抗原TMGに反応する複数のTCRの同定に成功した。
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