2018 Fiscal Year Research-status Report

全ゲノム解析とCRISPR/Cas9を応用した大腸癌肝転移に対する新規治療戦略

Research Project

Project/Area Number	18K07316
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	本間重紀北海道大学, 医学研究院, 講師 (30533674)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	武冨紹信北海道大学, 医学研究院, 教授 (70363364) 横尾英樹北海道大学, 大学病院, 講師 (70399947) 川村秀樹北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (70645960) 神山俊哉北海道大学, 医学研究院, 准教授 (80322816)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	大腸癌肝転移 / 遺伝子変異 / コピー数変異 / オルガノイド / CRISPR/Cas9
Outline of Annual Research Achievements	国際がんゲノムコンソーシアムを中心に大腸癌の遺伝子変異解析はほぼ終了しているものの、肝転移に関する遺伝子変異については未だ未解明な部分も多い。近年、転移巣では原発巣とドライバー遺伝子が異なり、化学療法や分子標的治療の有効性が個人によって異なることが報告されている。我々は、同一症例の大腸癌原発巣と肝転移巣の双方を用いたゲノム解析により、原発には認めず肝転移にのみ有意な遺伝子変異(BRAF, TGFβR2、RNF43, P16 INK4A, MLH1)と、コピー数(CN)変異(CTNNB1, PIK3CA, TGFBR2, FGFR1)を示した。本研究は、上記のドライバー遺伝子が大腸癌肝転移形成にどの様に寄与しているかを明らかにすることを目的とした。目的達成のためにまず上記遺伝子が治療標的となり得るドライバー遺伝子であるか否かの実証に着手し、原発巣、肝転移巣間で遺伝子プロファイルに差のあった遺伝子に対して、原発、肝転移、双方での蛋白発現レベルについて検討した。 CN解析で差のあった4遺伝子(CTNNB1, PIK3CA, TGFBR2, FGFR1)について免疫組織化学染色(IHC)を用いて蛋白発現を評価した。原発、肝転移においてCN上昇時にIHC陽性が一致する症例は82.6%、63.4%認めた。また原発に比べ肝転移でCNが上昇していた症例において肝転移でIHC陽性が一致する症例は57.7%で、原発と肝転移間でのCN上昇と蛋白発現に解離を認めた。その解離の要因を検討する必要が生じたため、現在、原発と肝転移でのエピゲノム解析によって各々の発現間の時空間的な関係を追加解析している。今後、上記ドライバー遺伝子の実証実験の後にオルガノイド樹立、CRISPR/Cas9を用いた変異遺伝子導入へ進む予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ドライバー遺伝子の蛋白発現を解析している段階であり、当初予定していたヒト正常大腸上皮幹細胞からオルガノイドを樹立するシステムの構築にはまだ至っていない。一方で、当初の予定とは異なる新知見が期待されており、全体として概ね順調に進んでいると評価する。
Strategy for Future Research Activity	原発巣と肝転移巣間での遺伝子発現解析を進め、DNAと蛋白発現間の差異について検討を行い、ドライバー遺伝子の絞り込み、再抽出を行う。その後にオルガノイド樹立、マウス移植・肝転移モデル実験を含めた候補遺伝子に関するin vitro, in vivoにおける検討を予定する。
Causes of Carryover	候補遺伝子の免疫染色解析、エピゲノム解析による追加検討を先行したため、当初予定していたオルガノイド樹立システムに必要な抗体や試薬の購入、解析費用の使用に至らなかった。上記追加検討が終了後、予定の試薬を購入する計画である。