2018 Fiscal Year Research-status Report
化学療法による免疫逃避能獲得機構の解明と薬剤耐性がんに対する新規治療戦略への応用
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18K07319
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
植松 美影 (濱田美影) 東京大学, 医科学研究所, 特任研究員 (90769449)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田原 秀晃 東京大学, 医科学研究所, 特任教授 (70322071)
内田 宏昭 東京大学, 医科学研究所, 特任准教授 (20401250)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | PD-L1 / MFG-E8 / 抗がん剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、最初に食道がん以外のがん種でも抗がん剤によって免疫逃避因子の発現が亢進するのかを検討した。ヒト乳がん由来細胞に抗がん剤処理をして、PD-L1およびMFG-E8のmRNA発現変動をreal time RT-PCRを用いて確認した。その結果、MCF-7細胞では、MFG-E８や転写因子Xの発現上昇がみられ、MDA-MB-231細胞では、PD-L1, PD-L2, MFG-E8, 候補転写因子Xの発現上昇がみられた。以上の結果より、抗がん剤による免疫逃避因子の発現亢進は、乳がん細胞でも起こると考えられたため、以降の実験では両方の細胞を用いて進行するとともに、マウスがん細胞の実験を消化管上皮由来と乳がん由来の細胞株で検討することにした。
次に抗がん剤による免疫逃避因子のタンパク質発現亢進を確認するため、TE-11細胞, MDA-MB-231細胞を用いて、flow cytometryにてPD-L1, MFG-E8の発現変動を測定した。その結果、TE-11に抗がん剤を72時間処理することで、PD-L1, MFG-E8のタンパク質発現量が亢進し、MDA-MB-231でもPD-L1のタンパク質発現量が亢進した。この結果より、抗がん剤によるPD-L1, MFG-E8の発現亢進を転写活性レベル、mRNAレベル、タンパク質レベルで確認することができた。
さらに候補転写因子Xによる 免疫逃避因子の発現亢進制御機構を詳細に解析するため、転写因子Xをクローニングし、doxycycline存在下で強発現するTet onベクターを作成した。このベクターをヒト食道がん細胞およびヒト乳がん細胞にレトロウイルスにて安定導入した細胞株を得た。この細胞株にdoxycyclineを添加し、real time RT-PCRに供したところ、doxycycline添加濃度依存的に転写因子Xの発現亢進を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は10月1日から3月31日まで産前産後休暇および育児休業を取得したため、研究活動が可能であったのは半年のみであった。その半年間では妊娠に伴う体調不良が続いたが、可能な限り研究を進めることができた。
4月から5月にかけてヒト乳がん由来細胞に抗がん剤処理をして、PD-L1およびMFG-E8のmRNA発現変動をreal time RT-PCRを用いて確認した。その結果を基に、in vivoで使用するマウスがん由来細胞の候補を挙げ、抗がん剤の至適濃度の決定、およびmRNA発現変動を5月から7月にかけておこなった。
また転写因子Xのクローニングを4月より開始したが、繰り返し配列が多くPCRでは増やしにくいという課題があったため、コドンが変わらない形で転写因子Xの全配列を合成し、Tet Onベクターへの導入が完了したのが7月となった。8月より、食道がん細胞株及び乳がん細胞株に対してレトロウイルスを用いてTet Onベクターの安定導入株を作成し、doxycyclineに対する応答性を現在進行形で確認している。
8月よりflow cytometryにてPD-L1, MFG-E8, 転写因子Xのタンパク質発現解析を開始した。転写因子Xを抗体染色するため、抗体を核内まで浸透させる方法やMFG-E8が分泌タンパク質のためタンパク質分泌阻害剤の添加方法に関する条件検討をおこなった。PD-L1, MFG-E8は抗がん剤を72時間処理することで、タンパク質発現量が亢進することまで確認することができた。転写因子Xに関してはflow cytometryで検出する実績が乏しいため、抗体の濃度検討やWestern blotting等他の検出系を今後検討する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
抗がん剤による免疫逃避能発現制御メカニズムの解明のため、Tet onシステムを用いて転写因子Xの発現量を制御できる細胞を作成した。しかしながら、doxycycline添加濃度依存的に転写因子Xの発現亢進を確認したのはmRNAレベルのみであるため、タンパク質レベルで発現が制御できているのかを確認する必要がある。そこでまず、細胞内を抗体染色しflow cytometryで検出する実験系を確立させる。転写因子Xに関してはflow cytometryで検出する実績が乏しく、flow cytometry用の抗体が１種類しか販売されていないが、転写因子Xの抗体のアイソタイプコントロール抗体がシフトしてしまうという課題がある。そこで、細胞の透過性を高める方法や抗体濃度を検討し、転写因子Xを特異的に染色する方法を検討する必要がある。またflow cytometryでは検出が難しい場合にはWestern blottingで確認することを考えている。タンパク質発現検出系を確立し、doxycycline の処理条件を最適化したのちに転写因子Xの発現量を増加させることが免疫逃避因子の発現に影響を与えるかどうかを検討したい。さらにsiRNAやCRISPR Cas9の技術を用いて転写因子Xの発現を負に制御する細胞の作製も試みる予定である。
次に免疫逃避能獲得担がんマウスモデルの確立のためマウス由来細胞の選定をおこなう。各種抗がん剤を処理し、免疫逃避因子のmRNAおよびタンパク質発現変動を確認し、マウス由来細胞と抗がん剤の組み合わせを決定する。さらにマウス由来細胞にTet OnやsiRNA、CRISPR Cas9のシステムを用いて転写因子Xの高発現、低発現細胞を作成し、それらの細胞を担がんしたマウスでの化学・免疫併用療法の効果を検証したい。
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| Causes of Carryover |
本年度は10月1日から3月31日まで産前産後休暇および育児休業を取得したため、研究活動が可能であったのは半年のみであった。その半年間では妊娠に伴う体調不良が続いたため、動物実験等費用がかかる研究ができず、また予定していた学会参加ができなかったため、旅費を使用することができなかった。
翌年度は動物実験を実施し、また学会にも参加したいと考えている。
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Research Products
(1 results)
