2019 Fiscal Year Research-status Report
化学療法による免疫逃避能獲得機構の解明と薬剤耐性がんに対する新規治療戦略への応用
| Project/Area Number |
18K07319
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
植松 美影 (濱田美影) 東京大学, 医科学研究所, 特任研究員 (90769449)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田原 秀晃 東京大学, 医科学研究所, 特任教授 (70322071)
内田 宏昭 東京大学, 医科学研究所, 特任准教授 (20401250)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | PD-L1 / MFG-E8 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までにヒト食道がん由来培養細胞およびヒト乳がん由来培養細胞に抗がん剤を添加することで、免疫逃避因子PD-L1, PD-L2, MFG-E8のmRNA発現が亢進することを確認している。今年度はこれら免疫逃避因子のタンパク質発現をFlow cytometryにて検出することでPD-L1, PD-L2, MFG-E8を発現している細胞集団を解析することとした。食道がん由来TE細胞に、抗がん剤を添加すると細胞表面上のPD-L1, PD-L2タンパク質の発現が亢進していることを確認した。またPD-L1の発現量が高い細胞集団ほどPD-L2の発現も高い傾向がみられた。乳がん由来MDA-MB-231細胞でも同様に抗がん剤刺激により細胞表面上のPD-L1, PD-L2タンパク質の発現が亢進していることを確認した。MFG-E8の発現亢進も確認し、PD-L1の発現量との相関はみられず、PD-L1の発現が低い細胞も高い細胞も一様にMFG-E8の発現が亢進していることがわかった。
これまでにPD-L1, MFG-E8のプロモーターアッセイにより、それぞれの発現亢進に重要なプロモーター領域を特定し、そこに結合する転写因子Xが推定されている。これら免疫逃避因子の発現制御の詳細を明らかにすることは、抗がん剤と免疫チェックポイント阻害薬との併用療法の効果予測マーカーや新たな併用薬の開発に寄与すると考えている。そこで、候補転写因子のsiRNAを食道がん由来細胞、乳がん由来細胞にそれぞれ導入することで、転写因子の発現低下がPD-L1, MFG-E8の発現亢進を抑制するのか否かについてreal time RT-PCRで確認をおこなった。その結果、転写因子Xの発現を抑制しても、PD-L1, MFG-E8の発現亢進に影響を与えず、別の転写因子YがMFG-E8の発現制御に関わっていることが示唆される結果を得た。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までにヒト食道がん細胞株およびヒト乳がん細胞株に抗がん剤を添加することでPD-L1, PD-L2, MFG-E8のmRNAおよびタンパク質の発現が亢進することを確認できた。MFG-E8に関してはこれまでWestern blottingやELISAでのタンパク質量の検出を試みてきたが、発現量が少ないことや分泌タンパク質であることから抗がん添加前後での量の比較が困難であった。そこでMFG-E8の発現量が高い乳がん細胞を用いてFlow cytometry解析し、MFG-E8タンパク質発現が抗がん剤処理により亢進することを確認することができた。さらにFlow cytometry解析により、PD-L1とPD-L2が協調的に発現亢進していること、PD-L1とMFG-E8は独立して発現亢進していることを示唆する結果を得た。以上のことより、抗がん剤により免疫逃避能を獲得したがん細胞の特徴の一端をとらえることができた。
抗がん剤刺激による免疫逃避能発現を制御する機構の解明に関しては、PD-L1, MFG-E8のプロモーターアッセイで発現制御への関与が推定された候補転写因子のsiRNAを用いて、転写因子の発現低下がPD-L1, MFG-E8の発現亢進を抑制するのか否かについて検証をおこなった。その結果、第一候補であった転写因子Xの発現を抑制しても、PD-L1, MFG-E8の発現亢進に影響を与えないということがわかり、PD-L1は、プロモーターの範囲を広げて結合する転写因子を再検索し、siRNAによるスクリーニングを現在進行している。MFG-E8に関しては、転写因子YがMFG-E8の発現制御に関わっていることが示唆される結果を得ることができ、現在はsiRNAを導入した細胞のFlow cytometry解析をおこなうことを計画している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
PD-L1, MFG-E8の発現を制御する転写因子の特定については、引き続きプロモーターアッセイで絞り込まれた候補転写因子のsiRNAを細胞に導入することで、PD-L1, MFG-E8のmRNA発現亢進に影響を与える転写因子を探索する。mRNAレベルで効果がみられたsiRNAについては、レポーターアッセイやFlow cytometry解析も同様におこない、その転写因子の発現減少が特定されたプロモーター領域での転写活性や、PD-L1, MFG-E8タンパク質発現にも影響を与えるのかどうかを確認する。また、Tet Onシステムによる転写因子強発現細胞やCRISPR Cas9による転写因子ノックアウト細胞を作成し、免疫逃避因子の発現に対する転写因子の関与について詳細に解析する。さらに、これまで扱ってきたヒト食道がん細胞株や乳がん細胞株における転写因子の発現量と免疫逃避因子の発現亢進の相関解析をおこない、この転写因子が免疫逃避能を獲得するか否かを規定する要因となるのか検証する。
次に免疫逃避能獲得担がんマウスモデルの確立を進める。マウス由来培養細胞に抗がん剤を処理し、免疫逃避因子のmRNAおよびタンパク質発現変動を確認し、マウス由来細胞と抗がん剤の組み合わせを決定する。次に実際に細胞を移植し、抗がん剤を投与して腫瘍での免疫逃避因子の発現変動を確認し、抗がん剤と免疫逃避因子の中和抗体との併用治療試験をおこなう。さらにマウス由来培養細胞にTet OnやCRISPR Cas9のシステムを用いて転写因子の高発現、低発現細胞を作成し、それらの細胞を移植したマウスでの化学・免疫併用療法の効果を検証する。
|
| Causes of Carryover |
今年度の計画分はおおむね使用したが、前年度の繰り越し分まで使用するに至らなかった。また、都合がつかず、学会にも参加していないため旅費を使用しなかった。次年度以降は動物実験やシーケンス解析の外部委託等で使用する予定である。
|
Research Products
(1 results)
