2020 Fiscal Year Research-status Report
Repertoirome analysis of antibody genes of peripheral blood memory B cells for qualitative evaluation of tumor associated immune response
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18K07334
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| Research Institution | Hoshi University |
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Principal Investigator |
築地 信 星薬科大学, 薬学部, 准教授 (90302611)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | がん / 免疫状態 / 抗体 / T細胞抗原受容体 / レパトア / 免疫記憶 / バイオマーカー / 末梢血 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
患者のゲノム情報を考慮した個別(プレシジョン)医療が推進されている。がん病態は、がん細胞の由来や遺伝的因子による個人差が大きく影響するために多様であり、それに対する免疫状態も多様である。次世代のがん治療法として免疫療法が注目されているが、治療が効果的であるのか、治療を持続するかどうかの判断が難しいのが現状である。そこで、免疫状態を正しく評価する指標(バイオマーカー)を同定し、治療効果の評価系を確立することを目的として研究を進めた。
担がんマウスを対象に、がん移植前と移植後9日目と21日目に採取した末梢血から、FACSにてB220陽性細胞とCD4陽性細胞の存在比率を測定し、経時変化を捉えた。9日目にB細胞の比率が増加し、21日目には減少した。それらの細胞をシングルセルソーティングにて単一細胞レベルに単離し、BCRsとTCRsの可変部領域の塩基配列を特異的プライマーにて増幅した。その結果、9日目に存在比率が変化した可変部として、Vh2-2、Vh1-50、Vh1-4、Vh1-80、Vh5-4、Vh1-47、Vk10、Vk3-2、Vk8、Va6、Va8、Va9、Vb12、Vb1、Vb29、Vb14が同定できた。
平成30年度は、体液性免疫の主役である抗体の「質」を評価するために「抗体遺伝子(BCRs)レパトローム解析法」を確立した。平成元年度は、マウスリンパ腫細胞株EL4およびE.G7-OVA細胞をマウスの皮下に移植することによる担がんマウスモデルでの解析を進めた。さらにT細胞の抗原受容体(TCRs)のうち、alpha鎖とbeta鎖の可変部領域の塩基配列解析方法を確立した。平成2年度には、新たに抗体遺伝子の認識特異性の解析を進める上で有用な一本鎖抗体(scFv-Fc)の作製方法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
担がんマウスを対象に、がん移植前と移植後9日目と21日目に採取した末梢血から、FACSにてB220陽性細胞とCD4陽性細胞の存在比率を測定し、経時変化を捉えた。9日目にB細胞の比率が増加し、21日目には減少した。それらの細胞をシングルセルソーティングにて単一細胞レベルに単離し、BCRsとTCRsの可変部領域の塩基配列を特異的プライマーにて増幅した。その結果、9日目に存在比率が変化した可変部として、Vh2-2、Vh1-50、Vh1-4、Vh1-80、Vh5-4、Vh1-47、Vk10、Vk3-2、Vk8、Va6、Va8、Va9、Vb12、Vb1、Vb29、Vb14が同定できた。
平成30年度は、体液性免疫の主役である抗体の「質」を評価するために「抗体遺伝子(BCRs)レパトローム解析法」を確立した。平成元年度は、マウスリンパ腫細胞株EL4およびE.G7-OVA細胞をマウスの皮下に移植することによる担がんマウスモデルでの解析を進めた。さらにT細胞の抗原受容体(TCRs)のうち、alpha鎖とbeta鎖の可変部領域の塩基配列解析方法を確立した。
平成2年度には、新たに抗体遺伝子の認識特異性の解析を進める上で、従来から問題となっていた軽鎖と重鎖の多量体形成の効率の変動を解消するために、一本鎖抗体(scFv-Fc)の作製方法を確立した。これは、軽鎖の可変部領域のC末端と重鎖のN末端がスペーサー配列を介して連結した構造をしている。
当初は抗体遺伝子のみの解析予定であったが、CD4陽性T細胞由来のTCRs(a/b)の解析も進めることができている。さらに同定できた抗体遺伝子可変部の結合特異性の解析を進めるために有用な一本鎖抗体の発現プラスミドベクターを構築できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度は、担がんマウスにおいて、9日目に存在比率が変化していた可変部に関する解析を重点的に進める。その方法として、抗体遺伝子については、軽鎖の可変部領域のC末端と重鎖のN末端がスペーサー配列を介して連結した一本鎖抗体を発現するプラスミドベクターを構築できているので、それを293A細胞に導入して、人工抗体として培養上清に産生させる。それらを用いて結合特異性の解析を進める。TCRsに関しては、可変部のアミノ酸配列や領域の長さなどに特徴があるか解析を進める。さらに担がんマウスに対して治療法を施し腫瘍を縮小させた条件で、末梢血を採取して変化していた可変部がどう変動するか解析する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス蔓延の影響を受け、消耗品の納期が遅れたため。
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[Presentation] ヒト由来細胞を利用した新規発熱性物質試験法の開発2020
Author(s)
奥輝明, 安藤祐介, 人見祐基, 築地信, 亀井淳三, 林克彦, 菊池裕, 菊池裕, 工藤由起子, 伊豆津健一, 辻勉
Organizer
日本薬学会年会140th
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