2019 Fiscal Year Research-status Report
術後補助化学療法効果予想マーカーに対するタンパク質相互作用創薬への分子機構の解明
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18K07341
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
三浦 奈美 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (80636978)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アクチニンー4 / アクチン / リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでに、アクチニン－４(ACTN4)が非小細胞肺がんの術後補助化学療法の効果を予測できるバイオマーカーであり、ACTN4タンパク質の発現が培養細胞の転移能と関係していることを明らかにしてきた。本研究では、このACTN4の細胞における転移能への寄与ついて、分子レベルでの解析を行なっている。
昨年度、ACTN4の野生型と２種の変異体（家族性糸球体硬化症の原因変異体と高悪性度肺神経内分泌腫瘍に特異的な選択的スプライシングからできる変異体）の組換えタンパク質とアクチンフィラメントの結合を、表面プラズモン共鳴法(SPR)により観察し結合様式の違いを明らかにした。今年度は、金沢大学との共同研究で原子間力顕微鏡を用い、ACTN4の野生型および２種の変異体とアクチンフィラメントの結合を動画撮影することに成功した。得られた画像を解析することで、３種のACTN4とアクチンの結合をSPRの結果との比較をすることができた。加えて、高解像度のACTN4-アクチンフィラメントの複合体像も得ることもできた。この像の解析を行うことで、ACTN4-アクチンフィラメントの構造解析が可能であると考えられる。
また昨年度、in vitro においてACTN4がEpidermal growth factor receptor (EGFR)によりリン酸化することを明らかにした。今年度は、生きた細胞内でのタンパク質-タンパク質の結合を測定できる生物発光共鳴エネルギー移動（Bioluminescence resonance energy transfer : BRET）法の実験系を作製した。そしてこのBRET法の実験系を使い、生細胞内においてACTN4とEGFRが直接結合していることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和元年度に予定していた研究計画は下記の通りである。
１）ACTN4/アクチンフィラメント複合体の構造解析：原子間力顕微鏡を用いて、ACTN4-アクチンフィラメントの結合像を得ることができた。さらに、結合像は動画で得られていることから、今後詳細な結合様式について解析を進める予定である。
２）ACTN4の翻訳後修飾によるACTN4の機能解析：in vitroでACTN4をリン酸化するEGFRが、 ACTN4に細胞内で直接結合していることを明らかにした。さらに、ACTN4とキナーゼの細胞内での結合を解析する系を確立することができた。
以上の結果から、本研究は予定していた研究計画通りに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和２年度は下記の研究を行う予定である。
１）ACTN4/アクチンフィラメント複合体の構造解析：本年度原子間力顕微鏡を使用し測定することに成功したACTN4-アクチンフィラメント複合体像の詳細な解析を行い、ACTN4-アクチンフィラメント複合体の構造の解析を行う。また、得られた複合体像は動画であるため、ACTN4のアクチンフィラメントへの結合・解離を１分子単位追うことができる。この動画の解析を進め、ACTN4の野生型と２種の変異体の結合・解離を比較することで、ACTN4の野生型と２種の変異体の機能解析を行う。
２）ACTN4の翻訳後修飾によるACTN4の機能解析：ACTN4とEGFRのリン酸化および細胞内結合を測定する系を確立できたことから、その他のリン酸化候補キナーゼについても同様の実験を行い、ACTN4リン酸化責任キナーゼの絞り込みを行う。また、絞り込まれた責任キナーゼについて、それぞれのキナーゼ阻害剤を用いて、ACTN4のリン酸化の抑制および転移能の減少をできるか調べる。
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| Causes of Carryover |
理由：組換えキナーゼタンパク質のライブラリーの作製を計画していたが、手元に遺伝子を持っている物から優先して行なったため、新規の遺伝子購入が少なくなったため。
使用計画：公開されているデータベースの解析から候補キナーゼの種類が増えたため、組換えキナーゼタンパク質のライブラリーの規模を拡大することを計画している。そのため、それらのキナーゼ遺伝子の購入および機能解析に必要な試薬を購入し、研究を計画通りに進める。
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Research Products
(4 results)
