臓器横断的オミックス解析による神経内分泌腫瘍の診断・治療標的物質の探索

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07343
• Research Institution: Shizuoka Cancer Center Research Institute
• Principal Investigator: 大島 啓一 静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, 研究員 (10399587)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 神経内分泌腫瘍 / 腫瘍マーカー / ドライバー遺伝子 / オミックス解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、消化管や肺などに発生する神経内分泌腫瘍(neuroendocrine tumor：NET)に対して、腫瘍横断的にオミックス解析を行うことにより、NET個々の分子学的特徴を明らかにし、NET共通または臓器別診断ならびに治療標的分子を探索することを目的とする。3年間の研究期間内には、次の２点について明らかにすることを計画した。①血中腫瘍マーカーの開発を目指し、NET症例に共通的あるいは臓器特異的な発現を示す遺伝子を明らかにし、それら翻訳タンパク質の分泌状態をプロテオミクスにより明らかにする。②分子標的薬標的タンパク質を見出すため、既存のドライバー遺伝子を認めないNET症例に対して、新しいドライバー遺伝子を見つけ出す。
静岡がんセンターでは、腫瘍組織に対するオミックス解析研究であるプロジェクトHOPEを2014年1月に開始させた。その特徴は、手術で摘出された腫瘍組織について、その周辺組織、あるいは血液を比較対照として、全エクソン解析（whole exome sequencing, WES）及び全遺伝子発現解析（gene expression profiling, GEP）を行うことにより、がん個々の特徴を解明し、がん患者さんの治療や予後に関する情報提供、さらに将来的な診断や治療薬や方法の開発に役立てることである。
計画段階（平成29年10月時点）では、プロジェクトHOPEにおいて、15種以上の臓器からなる3,022症例におけるWES及びGEPデータが存在し、NET症例は51サンプルに認められた。平成30年度（計画1年目）においては、累計で4,252サンプルのデータを取得し、NET症例は65サンプルに認められた。これらNETサンプルについて、データマイニングを行い、各候補遺伝子の抽出作業を行った。また、NET細胞株に対する遺伝子発現及び分泌タンパク質のデータを取得した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究は、静岡がんセンターにおける腫瘍サンプルに対するオミックスデータベースを主体としたデータマイニング、ならびにマーカー候補タンパク質のプロテオミクス的検証およびドライバー遺伝子の検証実験から構成される。計画段階において、3,194サンプルに対する全遺伝子発現解析(GEP)および全エクソン解析(WES)データを取得し、その中の51サンプルにNET症例を確認した。計画1年目には約4,000種のサンプルに対するデータが取得できる見込みであった。
平成30年度の計画1年目において、累計で4,254サンプルのGEP及びWESデータを取得することができた。その中で、65サンプルにNET症例が認められた。これら65サンプルについて、腫瘍マーカーあるいはドライバー遺伝子候補を見出すために、GEP及びWESデータのマイニングを行った。具体的な研究計画に対する進捗状況を以下に記述した。
①NET腫瘍マーカー候補分子の探索。NET症例（65サンプル）と非NET症例（約4,000）の比較により、NET全般に特異的な発現を示す遺伝子を抽出した。また、質量分析を用いたプロテオミクスにより、NET細胞株の培養上清液画分に含まれるタンパク質を解析した。
②NETドライバー遺伝子候補の探索。NET症例65サンプルに対して、既知のドライバー的遺伝子変異、増幅または欠失、および転座の有無を検討した。次に、既知ドライバー変化を認めない症例について、GEP及びWESデータから、腫瘍サンプルで発現亢進かつコピー数上昇を認める遺伝子を抽出した。
以上、本年度における達成度は、計画通り4,000サンプルに対するGEP及びWESデータを用いて、目的のNET腫瘍マーカーならびにドライバー遺伝子候補を抽出することができた。一方、各候補遺伝子発現に対するRT-PCRの検討が未着手であったため、「やや遅れている」状況であると判断した。

Strategy for Future Research Activity

計画1年目では、NET症例65サンプルを含む、15以上の様々な臓器に由来する4,254サンプルに対して、全遺伝子発現解析(GEP)および全エクソン解析(WES)データを取得した。2年目においては、累計で5,000サンプルに対するデータの取得が予想されており、データマイニング作業を4,254サンプルと同様に行う。具体的な推進方針を以下に示す。
①NET腫瘍マーカー候補分子の探索。5,000サンプルのデータを用いて、NET症例と非NET症例の比較により、NET全般に特異的な発現を示す遺伝子を抽出する。また、NET症例間の比較により臓器特異的な発現を示す遺伝子を腫瘍マーカー候補として抽出する。候補遺伝子の中で、分泌性あるいは細胞膜タンパク質に定義されている遺伝子について優先的にNET細胞株における発現を確認する。その後、候補遺伝子の発現が認められるNET細胞株の培養上清液画分に含まれるタンパク質の解析を行う。質量分析の結果は、入手可能な市販抗体を用いて、ウェスタンブロッティングにより確認する。抗体の入手が不可能な場合あるいは抗体の特異性が低い場合は抗体の作製を検討する。分泌確認されたタンパク質については、ELISA測定系を構築し、血清サンプルでの検討を開始する。
②NETドライバー遺伝子候補の探索。5,000サンプルにおけるNETサンプルに対して、既知のドライバー的遺伝子変異、増幅または欠失、および転座の有無を検討し、既知ドライバー変化を認めない症例について、GEP及びWESデータから、腫瘍サンプルで発現亢進かつコピー数上昇を認める遺伝子を抽出する。候補遺伝子は、NET細胞株における遺伝子やタンパク質の発現を確認する。次いで、細胞株及びマウスを用いて、その過剰発現やノックアウト効果に対する細胞増殖や悪性形質転換性への影響を検討し、ドライバー遺伝子としての機能確認を行う。

Causes of Carryover

<理由>本年度（平成30年度）では、データマイニングにより、腫瘍マーカー及びドライバー候補遺伝子を抽出した。一方で、当初の計画より「遅れ」が生じた結果、計画予定であったRT-PCRによる候補遺伝子の個別な発現検討するまでには至らなかった。その結果、当該実験に関わる費用を次年度（令和元年度）に持ち越すことになってしまった。
<使用計画>次年度（令和元年度）では、上述した本年度（平成30年度）に目標を達成できなかった候補遺伝子に対するRT-PCRにより発現の確認実験、さらに当初の計画である腫瘍マーカー候補に対してプロテオミクス的検証を行う。年度後半には、ドライバー遺伝子候補に対する細胞株やマウスを用いた機能検証実験に着手する計画である。従って、研究費の請求は、タンパク質や細胞・動物実験に関連するものに加えて、本年度から持ち越すことになった遺伝子発現関連の消耗品に対して行う。また、当初の計画通り、学会誌への論文投稿目的として英文校閲費、及び国内学会における発表に対する出張費を申請する。

Research Products

• [Presentation] Potential drug-targetable driver oncogenes resulting from amplification and overexpression in 4,000 solid tumors (2018)
  • Author(s): Keiichi Ohshima, Takeshi Nagashima, Keiichi Hatakeyama, Sumiko Ohnami, Shumpei Ohnami, Yuji Shimoda, Tomoe Tanabe, Masakuni Serizawa, Yasuto Akiyama, Kenichi Urakami, Masatoshi Kusuhara, Tohru Mochizuki, Ken Yamaguchi
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会