2018 Fiscal Year Research-status Report
マイクロ流路デバイスを用いた伝播性α-シヌクレインの同定と伝播阻害システムの構築
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18K07371
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
田口 勝敏 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60462701)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | α-シヌクレイン / レビー小体 / パーキンソン病 / プリオン様伝播 / 細胞間伝播性分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
α-Synuclein（αSyn）を主要構成分子とする細胞内凝集体「レビー小体」はパーキンソン病に特徴的な病理学的所見である。レビー小体の形成領域はパーキンソン病の最初期には嗅球において観察されると共に、病気の進行に伴って下部脳幹から大脳皮質に向かって上行性に広がって行く。近年、神経細胞に障害を引き起こす過程において、高分子化したαSynが細胞間を伝播し、近傍の神経細胞内へ取り込まれることが重要であるとの報告が相次いだ。この細胞間伝播は「プリオン様伝播仮説」と呼ばれ、脳内で病変が伝播・拡大する分子メカニズムとして注目されている。
我々はこれまでに、レビー小体様凝集体を再現した病的培養神経細胞を一定期間培養した培地（conditioned medium）から高分子化したαSynの分離を行った。培地を濃縮後、ショ糖密度勾配遠心によって細分画を行い、Native-PAGE及びSDS-PAGEによって培地中に存在する高分子化αSynの分子量を算定すると共に、その凝集形成能についても検定を行った。その結果、病的神経細胞を培養した培地中には、ある特定の分子量を持つ、明瞭な高分子化αSynバンドを検出できることが明らかとなった。更に、この高分子化αSynを含む培地で健康な神経細胞を培養するとレビー小体様凝集体の形成を誘導することができた。
現在、本研究の主軸であるマイクロ流路デバイスを用い、病的神経細胞が分泌する細胞間伝播性αSyn-seedを高精度で分離、その生化学的解析を進めると共に、マウス脳内に投与することで、その in vivo での細胞間伝播能と細胞毒性についての検討を進めている。今後は我々が見出した細胞間伝播性分子に注目し、細胞間の伝播を効率的に抑制するストラテジーの開発を視野に進めて行く予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マイクロ流路デバイスを用いることにより、細胞間伝播性αSyn-seed分子をより高精度で（人工的Fibril分子の影響を除いて）分離し、またこれを生化学的に検出する実験系を確立した。これにより当該Seed分子について、過去に報告されているProtease K（PK）assayや分子間力顕微鏡による分子形態の解析が可能となった。PK assayの実施により、本分子の構造的性質を知ることができたと共に、今後は電子顕微鏡による詳細な分子構造の解析を実施する予定である。
更に現在、回収したαSyn-seed分子のタンパク量及びその実効濃度を高め、in vivo における細胞間伝播能を解析するため、当該分子をマウス脳内に投与し、一定期間飼育した後に免疫組織化学による凝集体の形成とその脳内伝播の検出を進めている。本研究によって我々が見出したαSyn-seed 分子の有する細胞毒性を明らかにすることができるのみならず、生きた病的神経細胞が自ら産生する細胞間伝播性 Seed の同定に繋がるものと期待される。今後は得られた情報を基に、神経保護ストラテジーの開発を目標として進めて行く予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究は、回収したαSyn-seed分子の性質について解析を進めると共に、神経保護ストラテジーの開発を目指す。
1) 原子間力顕微鏡（AFM）及び電子顕微鏡による分子形態の解析について、当該Seed画分をAFMのみならず、電顕を用いて観察し、Seed分子の形態を明らかにする。これまでの報告を踏まえ、特徴的な分子構造が存在するか、構造フィッティング解析を実施する。
2) レビー小体様凝集体の形成能について、一次病態神経の作製に用いたαSyn-Fibrilやこれまでに我々が調製したSeed画分の凝集形成能を比較し、その病原性を定量的にin vivo で評価する。
3) Seed分子に対する構造特異抗体の作製について、微量の抗原でも免疫可能な「試験管内免疫法」により、得られたSeed画分を用いてマウス脾臓細胞を免疫する。試験管内免疫の後、脾臓細胞はミエローマと細胞融合させ、ハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの中から、dot blot assay とELISAによって単量体やFibrilには反応せず、標的のSeed構造にのみ反応する構造特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。
4) 構造特異抗体による細胞間伝播の阻害効果の検証を行う。レビー小体 in vivo 再現モデルを用いて、同定したSeed分子に対する構造特異抗体が細胞間伝播を阻害し、神経変性を防ぐことができるか、検証する。構造特異抗体の投与は、マウス線条体にFibrilを注入すると共に、大脳皮質内へ構造特異抗体（あるいは対照として正常マウス由来精製 IgG 画分）をosmotic pumpを用いて持続投与する。脳内注入後、30日目に灌流固定を行い、大脳皮質におけるレビー小体様凝集体の形成効率を抗リン酸化αSyn抗体を用いた免疫染色によって評価する。
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| Causes of Carryover |
年度末に購入した試薬の価格が想定していた価格よりも安かったため次年度に持ち越した。
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Research Products
(6 results)
