酸化ストレス性細胞死抑制因子を指標とした神経変性疾患のバイオマーカーの同定

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07398
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 狩野 修 東邦大学, 医学部, 講師 (20459762)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 星 秀夫 東邦大学, 医学部, 講師 (30568382)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 筋萎縮性側索硬化症 / バイオマーカー

Outline of Annual Research Achievements

筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー型認知症（AD）の各診断基準を満たした神経変性疾患患者と年齢を適合させた健常者 (n=10) に対し、同意を得た上で採血を行った。ALSでは初回と4ヶ月おきの1年間 (計4回)、PDとADでは初回と6ヶ月、1年後 (計3回) に採血 (15 ml) を行なった。採取した血液は同日中にRNA用と血球分離用に分け処理 (単核球分離用採血管を用いて単核球を分離) し、－80 ℃で保存している。採血に平行して各疾患の臨床評価スケール (ALSFRS-R, 肺機能検査, Hoehn-Yahr分類, MDS-UPDRS, MMSE, ADAS-Jcogなど) を用い、スコア化して評価した。
NAIP蛋白質量の定量に関しては単核球分離用採血管を用いて単核球を分離した。全細胞抽出試薬を用いて蛋白質を抽出し、一定蛋白質濃度に調製したサンプルをPVDF膜にブロットし、抗NAIP抗血清によるドットブロット・蛍光強度測定法でNAIP蛋白質量を定量した(NAIPリコンビナント蛋白質を標準品とする)。また、RNA定量と蛋白質定量の2つのバリデーション法の同等性が確認された場合は、qPCR法のみで評価する予定である。NAIP量がALS患者群と健常者群で有意な差が見られたため、ALS患者群と疾患対照群（PDなど）とで差が見られるかどうかを現在検討している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

健常者は予定人数に達したが、ALS（n=30）やPD（n=10）,ならびにAD（n=10）患者は予定人数に達していない。ただ観察期間も含めて2年間で行う予定であるので、おおむね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

NAIP蛋白質の定量に加え、NAIP-RNAの定量も検討している。全血からRNA精製キット (NucleoSpin RNA RNA blood) を用いRNAを抽出する。RNA画分中のNAIP-RNAをインターカレーター法 (SYBR Green Ⅰ検出) － ワンステップqPCRで定量する。

Causes of Carryover

ヒト血液からRNA抽出の検討およびRNAの品質チェックを行なっている。NAIPプラスミドを鋳型としたqPCRを行い、プライマーが問題がないか確認する必要あったため次年度使用額が生じた。プライマーを数種類作成し、qPCRを実施する予定である。