酸化ストレス性細胞死抑制因子を指標とした神経変性疾患のバイオマーカーの同定

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07398
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 狩野 修 東邦大学, 医学部, 教授 (20459762)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 星 秀夫 東邦大学, 医学部, 講師 (30568382)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 筋萎縮性側索硬化症 / バイオマーカー

Outline of Annual Research Achievements

筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー型認知症（AD）の各診断基準を満たした神経変性疾患患者と年齢を適合させた健常者(n=10) に対し、同意を得た上で採血を行った。ALSでは初回と4ヶ月おきの1年間 (計4回)、PDとADでは初回と6ヶ月、1年後 (計3回) に採血 (15 ml) を行なった。採取した血液は同日中にRNA用と血球分離用に分け処理 (単核球分離用採血管を用いて単核球を分離) し、－80 ℃で保存している。採血に平行して各疾患の臨床評価スケール (ALSFRS-R、肺機能検査、Hoehn-Yahr分類、MDS-UPDRS、MMSE、ADAS-Jcogなど) を用い、スコア化して評価した。
NAIP蛋白質量の定量に関しては単核球分離用採血管を用いて単核球を分離した。全細胞抽出試薬を用いて蛋白質を抽出し、一定蛋白質濃度に調製したサンプルをPVDF膜にブロットし、抗NAIP抗血清によるドットブロット・蛍光強度測定法でNAIP蛋白質量を定量した(NAIPリコンビナント蛋白質を標準品とする)。また、全血から単離したtotal RNAを鋳型として定量的ポリメラーゼ連鎖反応で評価も行った。RNA抽出キットを道いてRNA抽出を行い、品質チェックも同時に行った。RNAの品質の指標であるRIN値が6．7－8．5と高い値を示しており、RNA分解の影響をうけていないと判断した。今後はNAIPプライマーの作製と特異性の検討を行っていく。NAIP発現の相関性を蛋白質及び遺伝子発現レベルで比較し、2つのバリデーション法の同等性が確認された場合は、qPCR法のみで評価する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ALS（n=30）、PD（ｎ＝10）、AD（ｎ＝10）に加え健常者（n＝10）からの採血は同意を得た上で採取した。NAIP蛋白質に加え、RNAの定量を行っている段階である。

Strategy for Future Research Activity

RNA抽出キットを用いて凍結ヒト血液試料からRNA抽出を行い、RNAの品質チェックを確認した。RNA抽出試薬添加後凍結保存されていた健常人全血、検討及び検量線作成用に採取した健常人全血約0.4mlから1.91ー4.79ugのtotal RNAが抽出できた。またRNAの品質の指標であるRIN値がおおむね6.7ー8．5と高い値を示しRNA分解の影響をうけてなく、ｑPCRの実施に影響がないと考えた。今後はNAIP遺伝子の情報を元に、4種類のNAIPプライマーを作製していく。

Causes of Carryover

NAIP遺伝子の情報を元に、4種類のプライマーを作製し、さらに標準物質NAIP plasmidを鋳型とし、KAPA SYBR Fast Universal を用いた2-step qPCRを実施する予定であるため。