2019 Fiscal Year Research-status Report
Pathogenesis of ALS linked p62-mutants from the point of view of autophagy and oxidative stress
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18K07505
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
徳田 隆彦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80242692) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 神経変性疾患 / ALS / p62 / オートファジー / 酸化ストレス応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ALSモデル細胞におけるp62の動態を観察するためにTDP-43_WTとA315T変異発現細胞を作製した。亜ヒ酸による酸化ストレス負荷によりTDP-43_A315T変異体は凝集体を形成した。これは内在性の野生型p62を発現する細胞での結果である。今後、この細胞でp62のALS変異体を発現する細胞で野生型TDP-43の凝集体形成を解析することにより、p62とALS発症機序を明らかにする必要がある。
これまでALS変異p62の細胞内での挙動はp62のN末端抗体でしか確認できていなかった。最近発売されたC末端側の抗体を入手したので、切断後のC末端断片の挙動も解析した。ウエスタンブロットの結果、酸化ストレスによって切断を受けたp62のC末端断片を検出した。また、免疫染色ではp62 C末端断片は細胞内に一様に分布していた。
次に、オートファジーを利用した神経変性疾患の新たな治療法を開発するために、p62のLC3結合ドメインとユビキチン結合ドメインから構成された組換え遺伝子を作製した。この遺伝子から発現するペプチドは神経変性疾患の発症に関与する異常タンパク質凝集体を拿捕し、オートファゴソームへ運搬する。この遺伝子をHEK293細胞へ導入したところ、細胞内で形成した異常タンパク質凝集体は減少していた。今後、TDP-43凝集体のクリアランスを効果的に行える解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ALS変異p62を切断するプロテアーゼの同定のためにMACタグ付きのp62安定発現細胞を作製し確認作業をおこなっているが、野生型p62発現細胞の作製が計画通りに進んでいない。
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| Strategy for Future Research Activity |
BioIDによるp62切断プロテアーゼの同定を行う。そのために昨年度構築した細胞を用い、BioID用のALS変異p62が酸化ストレス下で切断を受けるか確認を行う。確認ができたら、ビオチンによる標識を行い、質量分析でプロテアーゼの同定を行う。初代神経細胞にそして、神経変性疾患の治療薬の新規スクリーニング方法の開発を行う。恒常的にオートファジーを活性化する薬剤をスクリーニングするために、オートファジー抑制因子Rubiconの阻害剤のレポータースクリーニングを開発する予定である。
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| Causes of Carryover |
プロテアーゼ同定のために質量分析の受託を行う予定であったが、COVID-19パンデミックの影響で受託解析が停止したため。解析が開始したら質量分析を行う予定である。
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Research Products
(5 results)
