2018 Fiscal Year Research-status Report

神経再生機能分子LOTUSによるALS の治療法開発

Research Project

Project/Area Number	18K07532
Research Institution	Yokohama City University
Principal Investigator	田中章景横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (30378012)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	高橋慶太横浜市立大学, 附属病院, 助教 (20773740) 土井宏横浜市立大学, 医学部, 准教授 (10326035) 竹内英之横浜市立大学, 医学部, 准教授 (30362213)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	ALS / LOTUS
Outline of Annual Research Achievements	筋萎縮性側索硬化症（ALS）の神経変性は、運動ニューロン軸索遠位端のシナプスより軸索変性が始まり、細胞体へと進行していくdistal axonopathyの様式をとる。この分子病態を、ミエリン関連神経突起伸長阻害因子（MAIs）の一つであるNogoとその受容体であるNgR1を介するシグナル伝達が増強することから、Nogoに対するモノクローナル抗体(ozanezumab)の臨床応用が行われたが、第II相試験での有効性は示されなかった。しかし、NgR1はニューロンだけでなくミクログリアやTリンパ球にも発現しており、このシグナル系が中枢神経の炎症を惹起し、ALSにおける非自律性神経変性に関わると考えられる。そこで、我々はNogoを含むNgR1のすべてのリガンドとの結合を阻害し軸索伸長を促進するとともに、ミクログリア、Tリンパ球にも作用する新規神経再生機能分子LOTUSに着目した。本研究では、LOTUS遺伝子改変動物、リコンビナントLOTUSを駆使し、「神経変性」と「神経炎症」を同時に制御しうるALSの画期的な新規治療法の開発と病態解明を行う。平成30年度は、ALSモデルである変異SOD1(G93A)マウスとLOTUS欠損マウスの交配を行い、ロタロッドテスト、ワイヤーハングテストによる運動機能解析を進めている。preliminaryではあるが、LOTUS欠損変異SOD1(G93A)マウスは、17-18週頃より、運動機能の低下が見られ始めており、変異SOD1(G93A)マウスに比べて運動機能低下の速度が速い傾向にある。一方、LOTUS過剰発現SOD1(G93A)マウスにおいては、変異SOD1(G93A)マウスに比べて運動機能障害の進行が遅い傾向にある。現在のところ、ほぼ仮説通りの運動機能を呈しているが、今後さらに例数を増やし週齡を追っていきたい。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason LOTUS遺伝子改変マウスとALSモデルマウスの交配が順調にすすみ、運動機能解析でも、ほぼ仮説通りの結果が期待できそうなデータを得つつある。
Strategy for Future Research Activity	LOTUS遺伝子改変マウスとALSモデルマウスの交配を進め、運動解析を継続する。さらに、これらの脊髄運動ニューロンにおける病理変化、病変における活性化ミクログリア、炎症性物質の産生、Tリンパ球の浸潤について評価を行う。また、LOTUSの軸索伸長促進作用が変異SOD1(G93A)マウスのニューロンにおいても機能することを確認する。我々はこれまでに、野生型マウスの初代培養ニューロンにおいて、培養液中にリコンビナントLOTUSを添加することで、軸索伸長阻害分子であるNogoの存在下であっても軸索伸長が促進されることを確認している。そこで、ALSの確立された動物モデルである変異SOD1(G93A)マウスの初代培養ニューロン、変異型(G93A)SOD1を導入した運動ニューロン系細胞のNSC34を用い、培養液中にリコンビナントNogoまたはリコンビナントLOTUS、またはその両方を添加し形態・生存率を病理学的手法・生化学的手法を用いて解析する。病態関連サイトカイン・炎症性物質（iNOS, NOなど）の動態をmRNA及びタンパクの発現で解析する。一方で、siRNAによるLOTUSのノックダウンも行い、その影響を検討する。これにより、ALSの炎症病態とNogo-NgR1シグナルとの関連、LOTUSによる異常炎症の制御効果を明らかにする。また、これら、ミクログリア、ニューロン単独の解析に加え、変異SOD1(G93A)マウスのミクログリア/ニューロン共培養系でも、上記と同様の解析を加えるとともに、ニューロンの形態・生存率を解析し、「神経変性」、「神経炎症」という二つの病態を同時に制御しうるLOTUSによる治療効果をex vivoで明らかにする。
Causes of Carryover	今年度は、マウスの交配と運動機能解析を先行して行ったため、細胞培養系のex vivoの解析で予定したいた各種試薬の使用量がそれほど多くなかったため、次年度使用額が発生した。次年度は、これらを使用し、マウスの病理学的解析、生化学的解析に加え、細胞培養系実験を行っていく。