Establishment of ALS model by artificial RNA-binding proteins related to ALS proteinopathies.

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07534
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 伊東 大介 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (80286450)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 筋萎縮性側索硬化症 / 前頭側頭型認知症

Outline of Annual Research Achievements

これまで同定された筋萎縮性側索硬化症(ALS)/前頭側頭型認知症(FTD)を引き起こす原因遺伝子6つTDP-43, FUS, TAF15, ESWR1, hnRNPA1, hnRNPA2は，生化学的，細胞生物学的に共通性が見られる. すなわち1) RNA recognizing motif (RRM) を持つRNA結合蛋白である. 2) prion-like domain (PrLD) を持ち凝集性が高い. このPrLDはアミノ酸配列において2つの特徴がありglycine/serine-tyrosine glycine/serine (G/S-Y-G/S)の繰り返し配列があり，さらにglutamine (Q)に富む.　3) ストレス顆粒の構成分子である.　4) 患者死後脳で細胞質への局在異常を起こし封入体を形成する. 本研究では、上記4つの特徴を持つアミノ酸配列を人工的に設計し、そのcDNAをマウスに導入することにより、人工ALS/FTDモデルを作成、その分子機構を解析する.我々は、すでに、このALS病態誘導人工遺伝子を培養細胞に導入することによって、封入体形成、ストレス顆粒への移行、細胞毒性、凝集を確認しておりALS関連分子の細胞学的特性を再現できたと考えている.
一方、近年では、多くのALS原因RNA結合蛋白の構造上、C末端アルギニン―グリシンリッチドメインが、ストレス顆粒の形成や凝集性に重要であることが報告されている. 本年度は、ALS病態誘導人工遺伝子の改良のため、RNA結合部位の下流に、アルギニン―グリシン―グリシン(RRG)リピート（12，20リピート）を挿入し、培養細胞に導入、封入体形成率、凝集性を検討した. 12，20リピートともに、封入体形成率（リピートなし:15.4±2.8%, 12リピート:10.3±1.8, 20リピート:12.1±2.4）、ウエスタンブロット上凝集性の上昇は認められなかった. 以上より、人工遺伝子においては、RGGリピート挿入によるALS関連分子の生化学的、細胞学的特性の増強は認められなかった.

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上記結果より、RGGリピートを挿入しないcDNAを用いて、ALS病態誘導人工遺伝子発現モデル動物の作成を推進している。Cre/loxPシステムを利用した誘導発現をもつALS病態誘導人工遺伝子遺伝子改変用ベクターをROSA26遺伝子座へのノックインベクターを作製した.　HEK293細胞では、Cre存在下で十分な発現を確認した.　ROSA26遺伝子座への挿入により外来遺伝の安定的ユビキタス発現とホモマウスでの解析が可能となる. 遺伝子改変用ベクターはすでに作成し、Crispr/cas9システムを用いた受精卵から直接ノックインマウスを行っている.
本研究の申請後、下記2つの国際紙に論文掲載された。ALSの病態解明に向けて確かな進達を認めている。
1)　Ito D, Hatano M, Suzuki N. RNA-binding proteins and the ALS/FTD pathological cascade. Sci Transl Med. 2017; 9(415)
2)　Mitsuhashi K, Ito D, Mashima K, et al. De novo design of RNA-binding proteins with a prion-like domain related to ALS/FTD proteinopathies. Sci Rep. 2017; 7(1):16871

Strategy for Future Research Activity

本マウスが樹立した場合、生化学的（SGマーカー、TDP-43、不溶分画、細胞質分画）、組織学的検査を行いその神経変性過程を検討する. 特に、脊髄前角、末梢神経の変性は詳細に行う. 行動解析としては生存曲線を比較するとともに、footprint、Rota-rod treadmill、hanging wire testを評価して運動能力、活動性を定量的に解析する. 本研究により、ALS病態誘導人工遺伝子が神経変性のトリガーとなることをin vivoで証明するとともに、運動ニューロンの選択的変性の分子機構をin vivoレベルで解析が可能となり、新規治療戦略の確立、薬剤の評価への利用が期待できる.
一方、すでに我々が確立しているALSモデル遺伝子改変マウス（△NLS-FUSのtgマウス）の解析も進めている.　若年性ALSの変異を持つ本tgマウスは、8週齢より過活動、記憶障害、社交性の障害などFTDの表現型、12週より進行するALS様の運動障害を呈する．ゴルジ染色では、15週齢前頭葉、海馬にて樹状突起スパインの密度の低下、miniature excitatory postsynaptic currentの出現が低下しており電気生理学的な障害も確認できている.　現在本マウスより、前頭葉、海馬、脊髄のRNA seq.を行い変動する遺伝子を網羅的に解析している.　本研究により、ALS/FTDの病態への関連が示唆される遺伝子群の同定に成功し、バイオマーカーへの応用や治療ターゲットにつながる可能性が期待される.

Causes of Carryover

従来からの計画では本年度に、ALS病態誘導人工遺伝子発現モデル動物の作製費用を計上する予定であったが、近年の論文より人工遺伝子の改良の必要性がありモデル動物の作製依頼が半年ほど遅れることとなった。モデル動物作製費用は、成功報酬であり今年度の計上がなされず、予算の繰り越しを依頼するものである.

Research Products

• [Journal Article] Can we predict amyloid deposition by objective cognition and regional cerebral blood flow in patients with subjective cognitive decline?" (2019)
  • Author(s): Funaki K, Nakajima S, Noda Y, Wake T, Ito D, Yamagata B, Yoshizaki T, Kameyama M, Nakahara T, Murakami K, Jinzaki M, Mimura M, Tabuchi H.
  • Journal Title: Psychogeriatrics Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/psyg.12397.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Impact of a Combination of Quantitative Indices representing Uptake Intensity, Shape, and Asymmetry in DAT SPECT using Machine Learning: Comparison of different Volume-of-Interest Settings. (2019)
  • Author(s): Iwabuchi Y, Nakahara T, Kameyama M, Yamada Y, Hashimoto M, Matsusaka Y, Osada T, Ito D, Tabuchi H, Jinzaki M.
  • Journal Title: EJNMMI Research Volume: 9 Pages: 7
  • DOI: 10.1186/s13550-019-0477-x
• [Journal Article] Quantitative evaluation of the tracer distribution in Dopamine Transporter SPECT for objective interpretation. (2018)
  • Author(s): Iwabuchi Y, Nakahara T, Kameyama M, Yamada Y, Hashimoto M, Ogata Y, Matsusaka Y, Katagiri M, Itoh K, Osada T, Ito D, Tabuchi H, Jinzaki M.
  • Journal Title: Ann Nucl Med. Volume: 32 Pages: 363-371
  • DOI: 10.1007/s12149-018-1256-x. Epub 2018 Apr 13.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Tau-PET IMAGING OF ALZHEIMER AND NON-ALZHEIMER DEMENTIA USING 18F-PI 2620. (2019)
  • Author(s): Mimura M, Tabuchi H, Ito D.
  • Organizer: . Alzheimer's & Parkinson's Diseases Congress.
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] De novo design of a cytoplasmic rna-binding protein with a prion-like domain related to als/ftd proteinopathies. (2018)
  • Author(s): Ito D, Mitsuhashi K, Suzuki N.
  • Organizer: 5th RNA Metabolism in Neurological Disease Conference.
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Disclosure of amyloid status for risk of Alzheimer’s disease to cognitively normal persons with subjective cognitive decline (2018)
  • Author(s): Wake T, Tabuchi H, Funaki K, Ito D, Yamagata B, Yoshizaki T, Kameyama M, Nakahara T, Murakami K, Jinzaki M, Mimura M
  • Organizer: Alzheimer's Association International Conference
  • Int'l Joint Research