2018 Fiscal Year Research-status Report
Molecular pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis
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18K07537
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
相澤 仁志 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (10292103)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
郭 伸 東京医科大学, 医学部, 特任教授 (40160981)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 筋萎縮性側索硬化症 / ADAR2 / nuclear isomerase Pin1 / importin-α4 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1．孤発性筋萎性側索硬化症(ALS)の脊髄運動ニューロン死にはAMPA受容体を介したCa2+の過剰な流入が関与している．AMPA受容体を介したCa2+流入はAMPA受容体サブユニットであるGluR2のQ/R部位の編集酵素adenosine deaminase acting on RNA2(ADAR2)の活性低下による．本年度、ALS脊髄運動ニューロンにおいてADAR2を制御するnuclear isomerase Pin1の細胞質内発現が増加していること明らかにした．また、ADAR2核内輸送に関与するimportin-α4(KPNA3)の核膜での発現が低下していることを明らかにした。同様の変化が孤発性ALSの病態モデルであるAR2マウスでも見られることを確認した。AR2マウスのmatingが遅れたためwestern blot analysisに関しては今後行う予定。Matingは2019年4月の時点で成功している．
2．Pin1およびimportin-α4のADAR2に及ぼす影響を検討するためのADAR2活性測定系を、ADAR2によるA-to-I編集率を測定するために、exon11のQ/R部位を含むGluR2 mini-gene(pre-GluR2)をpTRE-Tight Vectorを用いてTet-on-Hela cell (Clontech)にtransfect したHeLa細胞(TetHeLaG2m細胞)で確立した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね順調に進展し、ALSにおけるPin1およびimportin-α4の発現に関するデータを取得した。また、ADAR2活性測定培養細胞系についても確立できた。ALSの病態モデルマウス(AR2)を用いたwestern blot analysisを現在行なっている．
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| Strategy for Future Research Activity |
1．AR2マウスの脊髄前角のサンプリングを行いwestern blot analysisによりPin1の発現の増加を確認する．
2．Pin1阻害およびPin1過剰発現によるADAR2活性への影響
Pin1阻害薬およびsiRNAによりADAR2活性への影響を検討する．また、Pin1の過剰発現によるADAR2活性への影響を検討する．ADAR2酵素活性の測定はTetHeLaG2m細胞を用いRNAを抽出(RNAeasy Mini Kit: QIAGEN #74104)．遺伝子特異的なプライマーを用いたRT-PCR(Superscript TMII)によりcDNAを合成した後、Nested PCRを用いてGluR2 Q/R部位を含む領域を増幅する．増幅したPCR産物を制限酵素であるBbVⅠによる酵素処理を行なった場合、未編集型のGluR2では編集型GluR2では出現しない切断断片が出現する．2100Bioanalyzer(Agilent Technologies)により泳動後のバンドを定量し(B)、編集率(ADAR2活性)を算出する、切断断片の濃度比からGluR2 Q/R部位のRNA編集率を算出する．ADAR2活性を増加させる因子はALSの治療ターゲットとなる可能性がある．
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| Causes of Carryover |
AR2マウスの研究に関する費用が次年度に持ち越したため．
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Research Products
(1 results)
