2019 Fiscal Year Research-status Report
Molecular pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis
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18K07537
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
相澤 仁志 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (10292103)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
郭 伸 東京医科大学, 医学部, 特任教授 (40160981)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 孤発性筋萎縮性側索硬化症 / Pin1 / nucleoporin / ADAR2 / TDP-43 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
孤発性筋萎縮性側索症(SALS)ではRNA編集酵素であるadenosine deaminase acting on RNA2(ADAR2)の酵素活性が疾患特異的、運動ニューロン特異的に低下し、ADAR2のconditional knockout (AR2) miceでもALSと同様の臨床症状と病理変化をきたすことから、SALSの病態にADAR2活性の低下が関与していると考えられている。ADAR2の核内への輸送にはnucleoporinの一つであるimportin-α4が関与し、また、ADAR2はnuclear isomerase Pin1により制御されることから、importin-α4とPin1はいずれもADAR2活性の維持に重要と考えられる。
これまでに正常の脊髄運動ニューロンではPin1の発現は極めて少ないことを明らかにした。またSALSの脊髄運動ニューロンでは正常と変わらないものが多いが、一部の小径運動ニューロンではPin1発現が増強していることを明らかにした。さらにPin1高発現運動ニューロンではTDP43病理を伴っていることを明らかにした。一方、細胞質と核の間の輸送に関与するnucleoporinは正常運動ニューロンでは核膜に沿って発現しているが、SALSの脊髄運動ニューロンでは、TDP-43病理を有する病的運動ニューロンでのみnucleoporinの発現低下を認めることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒト試料を用いたPin1およびnucleoporinの発現に関する研究は予定通りの進捗状況である。ALSモデルマウスでの検討は、モデルマウスの作成がやや遅れたことから、検討がやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
遅延していたモデルマウス脊髄運動ニューロンでのPin1およびnucleoporinの発現実験を遂行する。
次にPin1による培養細胞のADAR2活性への影響を検討する。まず、ADAR2活性測定のHeLa細胞系を確立する(TetHeLaG2m細胞)。ADAR2によるA-to-I編集率を測定するために、exon11のQ/R部位を含むGluA2 mini-geneをデザインする。Exon11とintron11、intron11とexon12を別々にPCRで増幅し、PCR産物をMul1を用いてdigestする。最終PCR産物をintron11内にあるSpel1 restriction sitesでligationする。できたGluA2 mini-gene(pre-GluA2)をpTRE-Tight Vectorを用いてTet-on-Hela cell(Clontech)にtransfectする（TetHeLaG2m細胞）、次にPin1による培養細胞のADAR2活性への影響をPin1阻害（阻害実験）、Pin1 過剰発現(pLenti6/V5-GW/lacZ vectorを用いPin1をTetHeLaG2m細胞に過剰発現させる)によりPin1のADAR2活性への影響を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
マウスを用いた研究の遅延のため使用金額が少なかった。次年度中にマウスを用いたPin1、nucleoporinの発現実験を行う予定。
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Research Products
(6 results)
