2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of newer animal model, biomarker, and treatment of depression by regulation of BDNFgene methylation using genome editing
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18K07575
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| Research Institution | Kibi International University |
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Principal Investigator |
森信 繁 吉備国際大学, 保健医療福祉学部, 教授 (30191042)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
淵上 学 広島大学, 病院(医), 講師 (40403571)
田尻 直輝 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (80782119)
津田 雅之 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 准教授 (90406182)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | BDNF / DNAメチル化 / うつ病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
BDNF遺伝子のDNAメチル化状態を脳局所で操作する目的で、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）とエフェクタードメインの融合遺伝子、guide RNA（gRNA）を発現するレンチウイルスベクターを作製することにした。エフェクタードメインとして、脱メチル化亢進用にはTen-eleven translocation（Tet1）を、メチル化亢進用にはDNA methyltransferase 3a（Dnmt3a）を用いた。まず、BDNF遺伝子のExon IVプロモーター上の11個のCpGを標的としたgRNAをデータベース上で5つ選択し、それぞれの発現プラスミドを作製した。このプラスミドをウイルスパッケージング用培養細胞（H293T細胞）に導入し、48時間後に回収した培養上清を精製・濃縮することで組換えウイルス粒子を得た。得られたウイルス粒子は、ELISAや細胞への感染によって力価測定を行い、高力価のウイルス粒子を得ることができた。また、dCas9-Tet1およびdCas9-Dnmt3aについても同様に行い、力価の高い組換えウイルス粒子を作製した。次に、これらのウイルス粒子を用いて、培養細胞内のBDNF遺伝子のメチル化状態を解析することにした。細胞には17日齢のマウス胎児脳から単離した初代神経培養細胞を用いた。神経細胞では、BDNF遺伝子の発現とExon IVプロモーターのCpG配列のメチル化が相関している。そこで、dCas9-Tet1と各gRNAのウイルス粒子を細胞に感染させ、感染2日後に細胞からRNAとゲノムDNAを抽出した。RT-PCRによりBDNF遺伝子の発現を調べたところ、いくつかのgRNAにおいて発現の減少がみられた。DNAのメチル化状態については現在解析中である。今後は、ウイルス感染後の時間や、gRNAの組み合わせなどについても検討していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス脳内のBDNF遺伝子Exon IVプロモーターのメチル化率の人工操作を行い、最終的には新たなうつ病動物モデルを作製する目的で、本年度は上記概要に記載した実験を行った。これらの実験成果は研究初年度としては、おおむね最終目標達成にむけて妥当な進捗状況と考えられるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度：上記5種類の組み換えウイルス粒子を導入した培養細胞を対象に、BDNF遺伝子メチル化率を計測し、中で最もメチル化率に変化を及ぼしたウイルス粒子を同定する。そのウイルス粒子をマウスの脳局所に注入し、うつ病様行動を解析する。
最終年度：うつ病様行動を呈したマウスのウイルス注入部位での、BDNF遺伝子のメチル化率およびBDNF mRNA発現を解析する。
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