2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of newer animal model, biomarker, and treatment of depression by regulation of BDNFgene methylation using genome editing
| Project/Area Number |
18K07575
|
|---|
| Research Institution | Kibi International University |
|---|
Principal Investigator |
森信 繁 吉備国際大学, 保健医療福祉学部, 教授 (30191042)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
淵上 学 広島大学, 病院(医), 講師 (40403571)
田尻 直輝 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (80782119)
津田 雅之 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 准教授 (90406182)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | BDNF / メチル化 / Tet1 / Dnmt3a / うつ病 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
うつ病の病態とBDNF遺伝子のメチル化障害との関連を解明する目的で、BDNF遺伝子のプロモーター (P) 領域のシトシン・メチル化をCRISPR-Cas9をベースとしたエピゲノム編集技術を用いて操作した。1) 細胞レベルでBDNF遺伝子のメチル化状態を操作するため、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）とエフェクタードメイン (ED) の融合遺伝子、guide RNA（gRNA）を発現するレンチウイルスベクター (LVV) を作製した。EDとして脱メチル化亢進用にはTet1を、メチル化亢進用にはDnmt3aを用いた。2) BDNF遺伝子のExon IV近傍の11個のCpGを標的としたgRNAを5つ選択し、発現プラスミドを作製した。プラスミドをウイルスパッケージング用培養細胞（H293T細胞）に導入し、培養上清から組換えウイルス粒子を得た。得られたウイルス粒子は、ELISAや細胞への感染によって力価測定を行い、高力価のウイルス粒子を得ることができた。また、dCas9-Tet1およびdCas9-Dnmt3aについても同様に行った。3) これらのウイルス粒子を用いて、培養細胞内のBDNF遺伝子のメチル化状態の操作を試みた。細胞には17日齢のマウス胎児脳から単離した初代神経培養細胞を用いた。この細胞にdCas9-Tet1と各gRNAのウイルス粒子を感染させ、感染2日後に細胞からRNAを抽出後、RT-PCRによりBDNF遺伝子の発現を調べたところ、対照群に比べて有意な発現の増大がみられた。Western blot法にて、タンパク質レベルでの発現上昇も確認した。4) 細胞から抽出したゲノムDNAを用いてＭassＡRRAY法で、P Ⅳ上のメチル化率の低下を検証した。これらの実験結果から培養細胞で、LVVを用いたdCas9-Tet1とgRNAの感染によって、BDNF遺伝子のメチル化状態を操作できることが分かった。5) 加えて、dCas9-Dnmt3aをもつLVVにより、DNAメチル化を亢進を検証した。
|
