2019 Fiscal Year Research-status Report
Lysosomal dysfunction and its pharmacological treatment in autism spectrum disorders
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18K07592
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
朱 紅 金沢大学, 子どものこころの発達研究センター, 博士研究員 (90778614)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 発達障害 / ミクログリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に続き、母体免疫・炎症活性化による発達障害モデルラットの作製条件の検討とライソゾーム関連分子の発現変化に関する実験を行った。妊娠7日前後のラットを業者から購入し、妊娠12日あるいは15日に合成二本鎖ポリヌクレオチド polyriboinosinic-polyribocytidilic acid [poly(I:C)]を母体に静脈注射し、胎児脳の遺伝子発現変化を調べるためにマイクロアレイ解析を行った。まず妊娠12日にpoly(I:C)あるいは生理食塩巣を母体に静脈注射し、妊娠15日に胎児ラットの脳からRNA を抽出し、遺伝子の発現変化を包括的に検討した。妊娠15日で遺伝子発現上昇を示した遺伝子の中に、ライソゾーム機能への関与が推定されるプロテアーゼをコードする遺伝子３種類が検出された。個々の遺伝子についてリアルタイムPCRによる確認を行っている。しかしながら、この作製条件で得られた仔ラットの行動解析を並行して行ったところ、顕著な異常が観察できなかった。そこで、特に妊娠15日目にpoly(I:C)を母体に静脈注射し、妊娠19日に胎児脳からRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を再度実施することした。この条件では仔ラットに不安行動が起こることも確認できたので、今後はこの方法に重点を置くことに決めた。poly(I:C)による母体免疫・炎症活性化モデルでは、胎児脳のライソゾーム機能が変調している可能性が示唆されるが、そのような変化がどのタイプの細胞で起こっているのかも免疫組織染色法にて確認中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
動物実験モデルの作製方法と研究対象とする分子がほぼ定まった。
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| Strategy for Future Research Activity |
1．リアルタイムPCRによる確認：ライソゾーム機能への関与が推定されるプロテアーゼをコードする遺伝子のリアルタイムPCR解析を行い、母体免疫・炎症活性化による変化の有無を統計学的に検定する。
2.ライソゾームの安定性の確認（ウエスタンブロット法）：ライソゾームの安定性の維持に重要な役割を果たしている膜タンパク[lysosome-associated membrane protein 1 and 2 (LAMP-1 and LAMP-2)] wo指標にして、以下の実験を行う。新生児期の発達障害モデルラットおよび対照ラットから脳を取り出してホモゲナイズした後、ライソゾームとサイトゾル分画を得る。ライソゾームとサイトゾル各分画をSDS ポリアクリルアミド電気泳動にて分離し、ウエスタンブロット解析を行い、検出バンドを定量比較する。検出用抗体として、抗LAMP-1 抗体、抗カテプシンB 抗体に加えて、ライソゾーム機能不全のバイオマーカーになり得ると報告されている抗Gpnmb（Glycoprotein non-metastatic melanoma b）抗体を、定量比較のための内部対照として、抗GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)抗体を使用予定である。
3. ライソゾームの安定性の確認（組織染色）：新生児期の発達障害モデルラットおよび対照ラットを4％パラホルムアミド溶液で灌流してから脳を取り出し、新鮮凍結切片を作製する。常法に従い、蛍光免疫染色を行う。一次抗体として、抗LAMP-1 抗体、抗カテプシンB 抗体、およびミクログリアマーカーとしてのIba1 抗体と抗CD11b 抗体を使用する。上記の免疫染色に加えて、ライソゾーム安定性の指標となるアクリジンオレンジ (acridine orange)を用いて染色する。
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| Causes of Carryover |
2018、2019年度中に計画していたリアルタイムPCRおよびマイクロアレイの解析回数が減ったためであり、繰り下げて2020年度に実施する予定である。
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