2021 Fiscal Year Research-status Report
Lysosomal dysfunction and its pharmacological treatment in autism spectrum disorders
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18K07592
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
朱 紅 金沢大学, 子どものこころの発達研究センター, 博士研究員 (90778614)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 自閉スペクトラム症 / ミクログリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続いて、妊娠18日の母体ラットに合成二本鎖ポリヌクレオチド polyriboinosinicpolyribocytidilic acid [poly(I:C)]を母体に静脈注射し、生後1日の新生児脳で遺伝子の発現変化を調べる実験を反復した。poly(I:C)によりV型H+-ATPaseのサブユニット遺伝子の発現上昇が検出することを再度確認した。これらの結果により、poly(I:C)による母体炎症では新生児脳のライソゾーム機能の変化が生じることが示唆された。また前年度までに、ミクログリア、樹状細胞（dendritic cell）および未分化なグリオーマ細胞に高発現する糖タンパクGpnmb (glycoprotein nonmetastatic melanoma b)がライソゾーム標識抗原CD68 (ED1) と同時局在することを見出していたため、in vitroでGpnmbのの有無を調べるために、このタンパクを大腸菌で大量発現させ精製する実験を開始した。推定膜貫通領域およびカルボキシル末端を除いた部分を融合タンパクとして大量発現させることに成功し精製条件の最適化を試みたが、中途でExpiTM Expression Systemも利用可能なことがわかったので、発現系を切り替えた。今後はExpi 293F細胞の発現させたGpnmbタンパクの大量精製を進め、神経系細胞におけるライソゾーム安定化作用を調べる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
大腸菌での組換えタンパクの発現と精製に時間がかかったことと、Expi 293F細胞の発現系に切り替えたため時間がかかったこととが主な理由である。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. Expi 293F細胞で大量発現させたGpnmbタンパクを精製し、神経組織由来細胞のライソゾーム分画に添加して形態学的変化を調べるとともに、前年度までに実施できなかった以下の実験に供する。
2. ライソゾームの安定性の確認（ウエスタンブロット法）：ライソゾームの安定性維持作用をもつ膜タンパク[lysosome-associated membrane protein 1 and 2 (LAMP-1 and LAMP-2)] を指標にして、以下の実験を行う。新生児期の発達障害モデルラットおよび対照ラットから脳を取り出してホモゲナイズした後、ライソゾームとサイトゾル分画を得る。ライソゾームとサイトゾル各分画をSDS ポリアクリルアミド電気泳動にて分離し、ウエスタンブロット解析を行い、検出バンド を定量比較する。検出用抗体として、抗LAMP-1 抗体、抗カテプシンB 抗体に加えて、ライソゾーム機能不全のバイオマーカーになり得ると推測するGpnmbに対する抗体を、定量比較のための内部対照として、抗GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase) 抗体を用いる。
3. 引き続き、ライソゾームの安定性の確認（組織染色）：新生児期の発達障害モデルラットおよび対照ラットを4％パラホルムアミド溶液で灌流してから脳を取り出し、新鮮凍結切片を作製する。一次抗体として、抗LAMP-1 抗体、抗カテプシンB 抗体、およびミクログリアマーカーとしてのIba1抗体と抗CD11b 抗体を使用し、蛍光免疫染色を行う。加えて、ライソゾーム安定性の指標となるアクリジンオレンジ (acridine orange)を用いて染色する。
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| Causes of Carryover |
感染症流行により実験施設利用が制限されたため、実験量が減った。
前年度分の実験を繰り下げて行うことに予算を割り当てる。
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Research Products
(1 results)
