Functional analysis of calcium channels related to intracellular stress signal transduction in bipolar disorder

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07594
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 上村 拓治 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (60377497)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 双極性障害 / 細胞内ストレスシグナル伝達 / カルシウムチャネル / CACNA1C / TRPC3 / GSK3β

Outline of Annual Research Achievements

本年度は以下の研究結果を得ることができた。
①　RNAiベクターを使ってTRPC3の発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株を作製し、CACNA1CおよびTRPC3 mRNAの発現をリアルタイムRT-PCRを用いて、定量的に測定した。その結果、TRPC3だけではなく、CACNA1C の発現量も低下していた。mRNAレベルではあるが、TRPC3の発現が低下しているとCACNA1Cの発現も低下していることがわかった。『CACNA1Cの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株で、TRPC3 ｍRNA量が増えている。』と前年度報告し、mRNAレベルではあるが、CACNA1Cの発現が低下しているとTRPC3の発現は上昇することを見出した。本年度に行った上記①との研究結果を組み合わせると、TRPC3⇒CACNA1Cというシグナル伝達が予想された。
②　気分安定薬であるリチウムは、GSK3βを直接的に阻害する作用を有している。GSK3βのmRNAレベルでの変動を確認するため、YKG-1細胞に、LiCl（0～2 mM）を投与し、0、1、3、7日後に各々の細胞を回収し、GSK3βmRNAの発現をリアルタイムRT-PCR法で定量的に確認した。リチウム濃度、時間依存的にGSK3βの発現量が低下することがわかった。
③　TRPC3およびCACNA1Cの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株を用いて、GSK3β mRNAの発現をリアルタイムRT-PCRで確認したところ、TRPC3の発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株ではGSK3β mRNAの発現も低下していた。興味深いことに、CACNA1Cの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株ではGSK3β mRNAの発現が上昇していた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

RNAiベクターを使ってTRPC3の発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株を樹立することができ、前年度樹立したCACNA1Cの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株も使用することで、mRNAレベルではあるが、TRPC3の発現が低下しているとGSK3βおよびCACNA1Cの発現が低下するが、CACNA1Cの発現が低下しているとTRPC3およびGSK3βの発現が上昇するといったGSK3β/TRPC3/CACNA1Cの細胞内シグナル伝達上の相互関係を見出すことができた。

また、LiClによる経時的、濃度依存的なGSK3βの発現変動も確認することができた。しかし、タンパクレベルでの確認を行うために、ウエスタンブロットの条件検討に時間がかかり、タンパクレベルでの確認を行っているところである。

Strategy for Future Research Activity

１）各遺伝子のタンパクレベルでの発現変動および細胞内Ca2+動態を蛍光プローブFura2AMで測定する。

２）In silico 解析で予測されたSNP rs1006737のA allele 特異的Nested gene（遺伝子X）を同定するため、ゲノム編集技術を用いて、YKG-1細胞で双極性障害のリスクバリアントであるSNP rs1006737のA allele 細胞株（CACNA1CA/A細胞株）を作製し、遺伝子Xの同定ならびにCACNA1C、TRPC3、GSK3βの発現量を検証する。

３）CACNA1C/TRPC3相互作用における遺伝子Xの機能を解析するために、①CACNA1CA/A 細胞株を用いて、リチウム（0～2.0 mM、0, 1, 3, 7日間）投与及びH2O2による酸化ストレス時のCACNA1C、TRPC3、GSK3βの発現変動、細胞増殖率を測定する。②リチウム（0～2 mM、0, 1, 3, 7日間）投与後、H2O2による酸化ストレス時の細胞内Ca2+動態を蛍光プローブFura2AMで測定する。

Causes of Carryover

本年度の研究で、ｍRNAレベルではあるが、CACNA1Cの発現量がS100βの発現に関与しているだけでなく、TRPC3の発現にも関与しているといった新しい知見を見出すことができた。しかしながら、新型コロナウイルス感染症の拡大もあり、SNP rs1006737のA allele 特異的Nested gene（遺伝子X）の同定および機能解析など思うように研究を進めることができない部分もあった。引き続きこれまで得られた研究結果を多角的に検証するためにも、タンパクレベルや細胞内カルシウム動態の変動などを確認しながら、SNP rs1006737のA allele 特異的Nested gene（遺伝子X）の同定および機能解析などを行う予定である。そのため、次年度へと繰り越して使用額の変更が生じた。