2020 Fiscal Year Research-status Report
Regulation mechaninism of DNA damage response and DNA focus formation during neural tissue development.
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18K07727
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| Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
栗政 明弘 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (80343276)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
桑原 義和 東北医科薬科大学, 医学部, 准教授 (00392225)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | DNA損傷 / 神経組織 / 未分化 / DNA損傷応答 / 放射線感受性 / 細胞周期 / 分裂細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA損傷部位に集積する53BP1融合蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いて、海馬神経細胞のDNA損傷応答(DDR)の一つであるDNA損傷フォーカス形成を検出するマウスを作成・解析してきた。海馬神経細胞では組織中であればフォーカス形成は抑制(Off)されているが、初代培養により分散培養するとフォーカス形成が再開(On)していた。高度に分化し組織内にある神経細胞ではDDRが抑制され、一方で未分化な状態に近づく初代培養下でDDRは再稼動する可能性
が示唆された。
このDDRのOn/Off制御に関する分子メカニズムと生物学的意義を明らかにするため、本年度は生細胞のタイムラプス顕微鏡撮影条件の確立と、そのための装置の設定に努めた。生細胞のタムラプス撮影においては、大学の共通機器として新規に導入されたZeiss社製のCellDIscoverer7（CD７）の撮影条件の設定と、撮影された画像解析ソフトの開発を行ってきた。また、生細胞ならびに生きた組織におけるDNA損傷誘導のための新規に導入された共焦点顕微鏡の条件設定の確立を
試みた。
共焦点顕微鏡によりレーザーを照射し、それにより生成されたDNA損傷から誘導されるフォーカス形成の程度を定量化することを試みた。海馬神経細胞と網膜神経節細胞を初代培養することにより、培養開始後１週間以内にフォーカス形成の誘導が確認できている。さらには、この誘導を引き起こす培養条件の検討を行なってきた。
本年度は、得られたレーザー誘導で形成されたフォーカスのタイムラプス動画画像をもちいて、画像解析用フリーソフトウェアであるImageJのマクロを用いて定量解析し、さらに統計解析ソフトウェアのRを用いて定量解析を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
理由
東北医科薬科大学の医学部は平成３０年度より新しく医学部キャンパスが新設され、それに伴い新規の共用研究機器の整備が開始された。新しい顕微鏡を含めた幾つかの関連機器が導入されたが、今後それらを実際に稼動させるために、条件設定を進める必要がある。現在その作業を進めている段階である。また、それらの装置で得られた画像を解析するソフトウェアなどの開発も並行して進めている状況である。
また、実験に用いるマウスに関しては、C57BL/6に対するバッククロスが終了し、遺伝的背景の揃ったトランスジーンをヘテロに有するマウスができている。導入したトランスジーンをホモに有するマウスを現在確立して、トランスジェニックマウスを安定して維持することを進めている状況である。
本年度は、共焦点レーザー顕微鏡によるフォーカス形成の実験系を確立し、タイムラプス画像からフォーカス形成の定量分析を可能とする画像解析ソフトを完成させ、それを用いて実際の解析を進めてきている。海馬神経細胞と網膜神経節細胞を初代培養することにより、培養開始後１週間以内にフォーカス形成の誘導されることが確認できているが、その程度は培養条件と培養期間により変化していることが明らかになっている。現在、より詳細な定量解析を進めてきている。
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| Strategy for Future Research Activity |
設定された条件をもとに、実際のマウスの2つの神経由来組織細胞（海馬神経細胞並びに網膜神経節細胞）の状況に応じたDDR応答の変化をより詳細に検討していく。また、こういったDDR応答の変化を引き起こす主たる要因をすでに特定しており、今後その定量解析によりその詳細を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症に伴い、研究室の利用が制限されたこと、また研究内容に変更があり、次年度以降に購入を延期している。
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[Presentation] LPSはラット初代培養神経系細胞とPC-12のKCC2発現を減少させる2021
Author(s)
富田和男, 山西沙祐里, 五十嵐健人, 桑原義和,田中康一, 北中純一, 北中順惠, 栗政明弘, 宮脇正一, 西山信好, 竹村基彦, 佐藤友昭
Organizer
第94回日本薬理学会年会 2021年3月8日-10日、北海道札幌市札幌コンベンションセンター
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[Presentation] ALOXによる酸化ストレス抵抗性制御2020
Author(s)
富田和男, 桑原義和, 鳥居征司, 五十嵐健人, 髙裕子, 長澤大成, 田中康一, 北中純一, 北中順惠, 栗政明弘, 西谷佳浩, 西山信好, 竹村基彦, 佐藤友昭
Organizer
第73回日本薬理学会西南部会 2020年11月21日（土） 熊本大学薬学部/オンライン開催 熊本県熊本市
