2019 Fiscal Year Research-status Report
静止期の細胞における重粒子線照射後のDNA二本鎖切断修復機構の解析
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18K07775
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
泉 雅子 国立研究開発法人理化学研究所, 仁科加速器科学研究センター, 専任研究員 (00280719)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 重粒子線 / DNA二本鎖切断 / DNA修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト正常線維芽細胞NB1RGBを血清飢餓により静止期に同調し、非相同末端結合反応に必要なDNA-PKの阻害剤（NU7441）存在下でＸ線や重粒子線（炭素線：70 keV/micrometer, アルゴン線：300 keV/micrometer）を照射したところ、いずれの場合も大幅にDNA二本鎖切断修復が阻害されたことから、非相同末端結合が主要な修復経路であることが示唆されていた。そこで、静止期の細胞の抽出液を作成し、ウエスタンブロットにより修復タンパク質の量を調べたとところ、代替的非相同末端結合や一本鎖アニーリングに必要なDNAポリメラーゼθやRad52の発現量が低下しており、非相同末端結合以外の反応が起きにくくなっていることが判明した。また、DNA-PK阻害剤存在下でも、リン酸化型ヒストンH2AXを指標にすると、X線、重粒子線いずれの場合も20%程度のDNA二本鎖切断修復が進行しており、DNA-PK非依存性の非相同末端結合が起きていることが示唆された。一方、静止期における重粒子線のリスク評価については、用いているNB1RGB細胞を安定的に未成熟染色体凝縮に導入することが困難であり、条件検討を進めているところである。
一方、修復阻害剤の生存率に与える影響を検討するため、HeLaをNU7441存在下でＸ線あるいは重粒子線で照射したところ、Ｘ線では２Gy以下で生存率が５倍以上低下したのに対して、６Gy以上では２倍程度だった。また、炭素線の照射では、2Gy以下では生存率が2－3倍低下したのに対して、3Gy以上では逆に二倍程度生存率が上がるという結果になった。このことは、低線量と高線量とで異なる修復経路が使われていることを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成31年度は、静止期において非相同末端結合によりDNA修復が起こる理由を生化学的に解析した。静止期における重粒子線のリスク評価については、用いているNB1RGB細胞が未成熟染色体凝縮に導入することが困難であり、別の方法も検討中である。一方、阻害剤の効果を検討する過程で、高線量と低線量とで異なる修復経路が使用されていることを示唆する興味深い結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
静止期の重粒子線のリスク評価については、未成熟染色体凝縮法の条件検討を行うことに加え、細胞を増殖期に導入した後にM期に導入して細胞を回収し、FISHにより染色体異常を解析することも検討する。
昨年度の結果から高線量と低線量とで異なる修復経路が使用されていることを示唆する興味深い結果が得られている。そこで、高線量と低線量において修復タンパク質の挙動がどのように異なるのか、修復タンパク質の局在を蛍光抗体法により解析したり、修復タンパク質のクロマチンへのリクルートを生化学的に解析することにより明らかにする。
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| Causes of Carryover |
当初想定していたよりもマシンタイムが少なく、試薬・消耗品の使用量が予定量より少なくなった。
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