2019 Fiscal Year Research-status Report
肝細胞癌との共通メカニズムに基づく肝芽腫の新規分子診断・治療開発
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18K07781
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
本多 昌平 北海道大学, 大学病院, 講師 (90588089)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北河 徳彦 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立こども医療センター(臨床研究所), 臨床研究所, 医長 (00585135)
鈴木 拓 札幌医科大学, 医学部, 教授 (20381254)
荒 桃子 北海道大学, 大学病院, 医員 (30741219)
田中 祐吉 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立こども医療センター(臨床研究所), 臨床研究所, 臨床研究所長 (50420691)
宮城 久之 旭川医科大学, 医学部, 助教 (50596442)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 肝芽腫 / miRNA発現異常 / DNAメチル化異常 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【研究の目的】肝芽腫は稀少癌であり解析対象とする検体を十分に得られないことから、これまでの肝芽腫研究を更に発展させるために症例数の多いHCC/stemlike subtypeを新たに解析対象に加え、肝発生過程からの逸脱と正常肝細胞からの脱分化に働く共通分子メカニズムに着目し、①DNAメチル化・miRNA発現異常に基づく分子診断による個別化治療の確立、および②miRNA発現制御による肝芽腫の進展抑制を目標とした新規治療法の開発を今後の肝芽腫研究の目標としている。
【研究の成果】
1.進行肝芽腫およびHCC/stemlike subtypeに共通する分子メカニズムの同定
当施設においてこれまでに切除されたHCCの中から本研究対象の候補として8症例を選別し、Moc-31,AFP,CK19免疫染色をおこなった。stemlike subtype症例として4症例を抽出し、それぞれの腫瘍部・正常肝部から選別して抽出したRNAを用いてGeneChip® miRNA4.0 ArrayによるmiRNA発現プロファイリングを施行した(現在外注委託結果待ち)。また肝芽腫・肝細胞癌の両方の性質を持つ10歳男児肝腫瘍症例の検体を用いて、それぞれ組織型の異なる領域から選別して抽出した核酸(DNA,RNA)を網羅的に解析(DNAメチル化,mRNAおよびmiRNA発現)した。
2.validation cohortを用いた新規予後予測パネルの作成
日本小児肝がんスタディーグループより供与された新規肝芽腫60症例分のDNAを用いて、これまでに予後予測因子として同定した7つの遺伝子(RASSF1A, CSF3R, TRAF5, PARP6, MST1R, OCIAD2, GPR180)につき、バイサルファイトパイロシークエンシング解析によるメチル化解析をおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HCC/stemlike subtypeに関して解析対象症例の抽出を終え、現在miRNA発現アレイ解析(外注委託)の結果を待っている所である。これまでに解析した肝芽腫サンプルを用いた遺伝子プロファイリングと比較照合することで共通した分子機構異常を明らかにし、次のステップである機能解析等に進むことが可能となる。
パイロシークエンサーによる予後予測分子マーカーパネルの作成については、先行研究から得られたDNAメチル化異常と本研究により得られる分子マーカーとを統合して、validation cohortを用いて解析し新規パネルを作成する予定である。現在各遺伝子のメチル化率測定は順調に進んでおり、最新の臨床データと照合する準備をおこなっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
肝芽腫細胞株を用いたin vitro解析については、当初よりターゲットにあげている14q32インプリンティング領域に位置する遺伝子(群)の発現制御機構に着目し、細胞株(HuH6,HepG2)を用いてまずはクラスターとして発現上昇しているmiRNAのうち肺転移巣において最も高値であった5つ(miR-493-3p, miR-431-5p, miR-432-5p, miR-487b-3p, miR-487a-3p)の発現レベルを多数検体において解析する（TaqManプローブによるリアルタイムPCR)。それらインプリンティング領域の調節機構として働くDifferentially methylated regions (DMRs)のメチル化解析をおこない、HCC, HBに共通した分子制御機構異常の解明をおこなう方針である。
当初予定していた肝芽腫xenograftモデルを用いたin vivo機能解析に関しては、非常に稀な肝芽腫の発生を予測することができず生標本処理によるモデル作成が困難であるため、これまでに蓄積してきた抗がん剤耐性機構に関わるin vitro実験と本研究とを統合し、新知見を得られるよう新たに上記miRNA機能解析を進めていく計画である。
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| Causes of Carryover |
HCC/stemlike subtype解析対象症例抽出のための免疫染色による判定および核酸の抽出に時間を要し、miRNA発現アレイ解析を提出(外注委託)したのが2020年度となった。次年度についてはこちらの解析を重点的に推し進め、従来の計画通り遺伝子プロファイリングからパイロシークエンサーによる解析およびin vitro解析へと順次研究を進めていく計画である。
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