CRP陰性若年性特発性関節炎のバイオマーカー探索

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07797
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 秋岡 親司 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60598093)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: バイオマーカー探索

Outline of Annual Research Achievements

若年性特発性関節炎の乾癬性関節炎型および付着部炎関連関節炎型の半数は、血清C反応性タンパク値が上昇しないため、炎症性疾患が疑われず、診断に至らない例が多い。一方、TNF-aおよびIL-17に対する抗体療法が有効であることから、これらの炎症病態にはTNF-a、IL-17が関与すると考えられる。そこで、若年性特発性関節炎の乾癬性関節炎型および付着部炎関連関節炎型患者血清にはTNF-aおよびIL-17の発現に関する分子が存在するとの仮説を立て、それら分子の探索を行っている。つまり、C反応性タンパク以外の炎症に関するバイオマーカーの探索である。
まず最初に、サイトカイン発現を検定するための細胞株を樹立した。平成３０年度はTNF-aの遺伝子発現の検定系を、ヒト単球白血病細胞株HL-60を用いて作成した。内因性の転写調節を反映させるため、通常とは異なりCRISPER/Cas9を用いた遺伝子編集の技術を使い、レポーター(ルシフェラーゼ)遺伝子のノックイン細胞株を得た。さらにシングルセルクローニングを経て２株樹立した。さらに安定した解析系のために無血清化を進め、無血清細胞株を得た。レポーター検出感度は非常に高く、TNF-a誘導時は非誘導時の約1000倍の蛍光を発し、高い感度を確認した。引き続き、IL-17に関して同様の方法を用い、ノックイン細胞株をヒト単球白血病細胞株HL-60およびヒトT細胞不死化細胞株において作成中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

IL-17A遺伝子座におけるレポーター(ルシフェラーゼ)遺伝子のノックイン細胞株の樹立に時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

当初の予定通り、転写レベルでのサイトカイン発現の検定系を確立した後、ホスファチジルセリンを用いたアフィニティー法で単離した患者血清由来エキソソームによるサイトカインの転写活性上昇を検定することで患者血清を分類する。つまり、TNF-a、IL-17の誘導の有無より４群（TNF-a発現誘導かつIL-17発現誘導TNF-a発現誘導かつIL-17発現誘導無し、TNF-a発現誘導無しかつIL-17発現誘導、TNF-a発現誘導無しかつIL-17発現誘導無し）に分類し、各群の患者血清由来エキソソームについて蛋白解析、核酸解析を網羅的に行う。そのプロファイルから特異的分子を絞り込む。選ばれた候補分子について多数検体で検定し、ROCカーブを用いてバイオマーカーとして有用か否かを判断する。今年度中にエキソソームのプロファイリングを完成したい。