神経細胞特異的なロコモーション移動におけるSrcファミリーキナーゼの役割

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07827
• Research Institution: Tohoku Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 西村 嘉晃 東北医科薬科大学, 医学部, 助教 (50508603)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川内 健史 公益財団法人神戸医療産業都市推進機構, その他部局等, 研究員(上席・主任研究員クラス) (60397544)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 神経細胞移動 / ロコモーション移動

Outline of Annual Research Achievements

大脳皮質形成過程において、脳室帯を出た神経細胞はまず多極性細胞になり、その後極性を獲得して一本の先導突起を持つロコモーション細胞となって脳表層までの長い距離を移動し、整然とした層構造を形成する。この神経細胞移動のうち、最も長い距離を占めるロコモーション様式の移動は、正常に機能する脳を作る上で極めて重要な過程であるにも関わらず従来直接的な解析が難しかった。申請者は独自の観察-解析系を確立し、Srcファミリーキナーゼがこの移動に重要な役割を果たしていることを示してきた。Srcファミリーキナーゼは、がん遺伝子として単離され様々な細胞現象に関わることが知られているが、脳におけるその主要な基質はロコモーション移動に関与しないことから、このキナーゼがどのようにしてロコモーション様式の移動を制御しているかは不明であった。本研究では大脳皮質のスライス培養法や超解像顕微鏡レベルでの細胞内小器官の動態解析、生化学的手法などを用いて、Srcファミリーキナーゼがロコモーション様式の移動をどのように制御しているかを、その上流・下流の経路まで解析して、脳形成における役割を明らかにすることを目的とする。本年度はSrcファミリーキナーゼであるFynやSrcなどの機能抑制によって移動のどの段階が異常になるかの解析として、子宮内エレクトロポレーション法を用いてEGFP発現ベクターおよびSrcファミリーのRNAiベクターを共導入した大脳皮質をミクロトームでスライスし、これを培養装置付顕微鏡下で撮影してロコモーション細胞をタイムラプス観察した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

FynやSrcなどの機能抑制によって移動のどの段階が異常になるかの解析として、子宮内エレクトロポレーション法を用いてEGFP発現ベクターおよびSrcファミリーのRNAiベクターを共導入した大脳皮質を振動刃ミクロトームでスライスし、これを培養装置付顕微鏡下で撮影してロコモーション細胞をタイムラプス観察した。その結果、Fynやその上流分子がロコモーション移動の制御に関与していることが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

Srcファミリーキナーゼの既知の大量な基質について、Srcファミリーキナーゼと相互作用するかを大脳皮質の初代培養神経細胞を用いた免疫沈降法で確認する。相互作用が確認された分子について、子宮内エレクトロポレーション法を用いてEGFP発現ベクターをRNAiベクターと共導入した大脳皮質をミクロトームでスライスする。培養装置付顕微鏡下でスライス組織片を撮影してロコモーション細胞をタイムラプス観察し、Srcファミリーキナーゼを阻害したときと類似した表現型が得られるか確認する。また、子宮内エレクトロポレーション法でEGFP-tubulinやEGFP-actinを共導入した大脳皮質をスライス培養し、微小管やアクチン細胞骨格の動態を観察する。ここでSrcファミリーキナーゼや下流候補分子を阻害したときの影響を観察し、形態変化への影響を評価する。さらに、子宮内エレクトロポレーション法でオルガネラ局在型のEGFPを導入した大脳皮質を超解像顕微鏡で観察する。

Causes of Carryover

年度途中に学部共通機器の共焦点顕微鏡がアップグレードされることになり一時使用できなくなった。次年度は同時に撮影するサンプル数を増やすことにより、当初使用を予定していた助成金と合わせて使用する。