Rett症候群における新規のエピジェネティックな生理活性物質産生メカニズムの解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07851
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 入江 理恵 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (90381178)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小戝 健一郎 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (90258418)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Rett症候群 / mecp2 / RNAi

Outline of Annual Research Achievements

雄のmecp2遺伝子欠損マウス(mecp2-/y)で得られた生理活性物質の変化を、in vitroにて安定的に再現できる細胞株を作製することができた。方法としては、shRNA-mecp2を搭載したレンチウィルスベクター感染によるRNAi法により候補組織の培養細胞においてmecp2遺伝子ノックダウンを行い、細胞分取によりmecp2遺伝子ノックダウン細胞の純化株を作製し、生体で見られた現象を再現することを可能とした。純化株を増殖させてストックした後、継代数を合わせて実験を行うことで、非常に安定的な実験を行うことができた。現在このmecp2ノックダウン細胞でこの物質の生合成経路に関係する遺伝子群、あるいはそのプロモーター領域を網羅的に分子生物学的手法(定量PCR、Western blottingなど)にて確認中である。
さらに上述に加え、mecp2遺伝子の発現レスキュー実験に着手し、内因性mecp2のノックアウト及び外因性mecp2発現レンチウィルスベクター(mecp2遺伝子の置き換えベクター)を構築し導入させて、上記と同種の細胞に感染させライン化を試みた。しかしながら、mecp2遺伝子を高発現させることにより細胞の増殖に影響が見られたため、こちらについては未だ細胞を安定して使用できていない状況である。今後なんとか改良し、細胞株を安定化させ、mecp2発現とそれに伴う上記生理活性物質の生合成経路に関する遺伝子群の発現変動を評価する予定である。
さらに、in vitroの系でmecp2ノックダウン細胞からTotal RNAを抽出し、マイクロアレイ解析(mRNAおよびmiRNA発現解析)とデータマイニングを行うための準備を進めている。また、ChIPシークエンスを実施し、MeCP2蛋白とゲノ全体のDNA結合部位を同定することにより、MeCP2蛋白の結合遺伝子を確定させ、対象細胞における産生物質合成経路の遺伝子制御ネットワークを解明するための計画・準備を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

mecp2遺伝子の発現レスキュー実験により、内因性mecp2のノックアウト及び外因性mecp2発現レンチベクター(mecp2遺伝子の置き換えベクター)を構築したものの、mecp2遺伝子を高発現させることにより細胞の増殖に影響が見られたため、この細胞を用いた安定した培養実験が開始できないところである。またmecp2遺伝子ノックアウト細胞株では、mecp2とどの遺伝子がダイレクトに関係しているかを突き止める段階までくることができたものの生理活性物質産生のパスウェイ上に存在する種々の遺伝子群を定量PCRにて一つ一つしらみつぶしに解析している段階であるが、プライマーの設計や実験の再現性の安定に時間を要した。また、本年度中には、最終年度に予定している真のRTTモデルであるmecp2遺伝子欠損雌マウス(mecp2/+)の作製と表現系・諸臓器形態を比較のための、動物の産生に着手する予定であった(動物産生自体が容易ではなく、非常に時間がかかるため)が、計画のみにとどまった。
神経系以外の組織での組織形成異常と、この原因とされる生理活性物質産生能の低下が関係していると推察され、RTTの神経系以外の器官での形態異常は未だ報告がほとんどないことから、独創性も研究価値も高いと確信しているが、上記理由のため海外論文投稿までは至っておらず、研究の進捗が遅れていると評価した。

Strategy for Future Research Activity

最終年度の計画は、研究成果を国内外へ発信することである。そのためにはmecp2遺伝子レスキュー(mecp2遺伝子をmecp2ノックダウン細胞またはRTTモデルマウスへ再導入)細胞株の安定化を最優先に行ない、機能回復が認められるかを確認する予定である。またいくつか変化がみられている生理活性物質産生のパスウェイ上に存在する種々の遺伝子群についても関連付けてまとめ、本年度中に国際雑誌への論文投稿、国内学会での成果発表を目指す。

Causes of Carryover

mecp2遺伝子の当該細胞への直接的関与を実証するための遺伝子ノックダウン細胞株では安定した結果が得られているものの、mecp2遺伝子の発現レスキュー実験により、内因性mecp2のノックアウト及び外因性mecp2発現レンチベクター(mecp2遺伝子の置き換えベクター)感染によりmecp2遺伝子を高発現させた細胞では増殖に影響が見られたため、この細胞を用いた安定した培養実験ができないところが問題点で時間を要した。どうしても機能回復の確認のためにどうしても長期的に継続してレスキューした細胞でも組織培養実験を行う必要性があるため進捗がやや遅れて、次年度使用額が生じた。