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2018 Fiscal Year Research-status Report

骨芽細胞の分化と石灰化におけるⅢ型ナトリウム‐リン酸共輸送担体の役割

Research Project

Project/Area Number 18K07866
Research InstitutionOsama Woman's and Children's Hospital

Principal Investigator

山崎 美和 (若林美和)  地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 環境影響部門, 流動研究員 (50455549)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
KeywordsPit1 / Pit2
Outline of Annual Research Achievements

骨基質の石灰化は、骨芽細胞から出芽的に分泌される基質小胞を介して開始され、骨芽細胞および基質小胞の膜上にはⅢ型ナトリウム/リン酸 (Na/Pi) 共輸送担体であるPit-1やPit-2が存在する。本研究においては、骨石灰化におけるⅢ型Na/Pi共輸送担体の役割について解析を試みた。Pi存在下で分化能を有するマウス骨芽細胞系細胞株MC3T3-E1 Subclone4にCRISPR/Casを適用することにより、Pit1ノックアウト(Pit1-KO)細胞とPit2ノックアウト(Pit2-KO)細胞を樹立した。Pit1-KO、Pit2-KO共にPi取り込み能は減弱していたが、3 mM Pi存在下で8週間培養した際の石灰化はむしろ亢進していた。3 mM Pi存在下で2週間培養した際のアルカリフォスファターゼ染色は全ての細胞において差は見られなかった。1, 4, 7 mM Pi存在下で24時間培養し、短期的なPi刺激に対する応答性を検討したところ、Pi刺激で惹起されるOsteopontinやDmp1の発現誘導はPit1-KO、Pit2-KOにおいてもコントロール細胞と同様に認められた。次に、Pit1やPit2の欠損がピロリン酸(PPi)代謝に及ぼす影響を検討するため、細胞内外のPPiを測定した。1 mM Pi存在下の細胞内PPiはPit1-KO、Pit2-KOではコントロール細胞と比して減少しており、全ての細胞で24時間の7 mM Pi刺激により細胞内PPiが低下した。一方、細胞外PPiは1 mM Pi存在下のPit1-KO、Pit2-KOで上昇しており、7 mMPi刺激では影響が見られなかった。PPiを細胞外へ輸送する膜蛋白質であるAnkの発現は7 mM Pi刺激で全ての細胞で有意に上昇した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Ⅲ型ナトリウム/リン酸共輸送担体をノックアウトした骨芽細胞株を作成し、ピロリン酸アッセイ系が確立でき、石灰化やピロリン酸代謝等に興味深い結果が得られているため。

Strategy for Future Research Activity

マウス骨芽細胞系細胞株MC3T3-E1 Subclone4にCRISPR/Casを適用しPit1ノックアウト(Pit1-KO)細胞とPit2ノックアウト(Pit2-KO)細胞を樹立した。Pit1-KO、Pit2-KO共にPi取り込み能は減弱していたが、3 mM Pi存在下で8週間培養した際の石灰化はむしろ亢進していた。ヒトにおけるPit2の機能喪失型変異は両側基底核に病的な石灰化を認める特発性基底核石灰化症を呈する。今後は骨における正常な石灰化と、他の組織での病的な石灰化におけるⅢ型Na/Pi共輸送担体の役割を明確にするよう解析を進める。

Causes of Carryover

当該年度は国際学会に参加しなかったため旅費の節約が可能となった。次年度は電子顕微鏡の撮影やプロテオーム解析の外注を予定しているためまとまった予算が必要となり、次年度分の請求助成金と合わせて使用する予定である。

  • Research Products

    (5 results)

All 2019 2018 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 1 results) Presentation (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] 3 CREB activation in hypertrophic chondrocytes is involved in the skeletal overgrowth in epiphyseal chondrodysplasia Miura type caused by activating mutations of natriuretic peptide receptor B.2019

    • Author(s)
      Yamamoto K, Kawai M, Yamazaki M, Tachikawa K, Kubota T, Ozono K, Michigami T.
    • Journal Title

      Hum Mol Genet.

      Volume: 28 Pages: 1183-1198

    • DOI

      10.1093/hmg/ddy428.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Intestinal clock system regulates skeletal homeostasis.2019

    • Author(s)
      Kawai M, Kinoshita S, Yamazaki M, Yamamoto K, Rosen CJ, Shimba S, Ozono K, Michigami T.
    • Journal Title

      JCI Insight

      Volume: 4 Pages: -

    • DOI

      10.1172/jci.insight.121798.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Phosphate as a Signaling Molecule and Its Sensing Mechanism.2018

    • Author(s)
      Michigami T, Kawai M, Yamazaki M, Ozono K.
    • Journal Title

      Physiol Rev.

      Volume: 98 Pages: 2317-2348

    • DOI

      10.1152/physrev.00022.2017.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 基質小胞性石灰化および骨芽細胞機能におけるⅢ型ナトリウム/リン酸共輸送担体の役割2018

    • Author(s)
      山崎美和、川井正信、大薗恵一、道上敏美
    • Organizer
      第36回日本骨代謝学会学術集会
  • [Remarks] 研究内容 環境影響部門 大阪母子医療センター[研究所]

    • URL

      https://www.wch.opho.jp/research/bone/content.html

URL: 

Published: 2019-12-27  

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