塩基変異の引き起こすエクソンスキップを分子機構の解明と治療法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07873
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 成戸 卓也 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, プロジェクト助教 (60438124)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: イントロン変異

Outline of Annual Research Achievements

対象遺伝子のイントロンに、エクソン配列の挿入変異により引き起こされるエクソンスキップが疾患に関わることを発見した。挿入変異の塩基を変化させることによりエクソンスキップをキャンセルさせることに成功したが、そのメカニズムは既存のスプライシング予測プログラム等では解決不能であった。これは、保存されている配列から予測されたシスエレメントが実際に選択性の制御に関わっているか否かの解析にはシミュレーションでは未解決であり、スプライシングに関わる部位のコンセンサス配列は高等生物ではかなり緩いものであるため、未だに何らかの実験的な解析手段が不可欠である。この挿入変異はエクソンスキップがオンオフと強力に作用しているため、機構を解明することは治療法の開発につながる。
正常および変異の配列に特異的に結合するスプライシングタンパクを単離するために、ミニ遺伝子を作成し各種蛍光RNAプローブとHeLa細胞核蛋白を結合させてゲルシフト解析を行った。しかしながらこの実験によって、結合するタンパクとシス因子が同定できていない。このためHeLa細胞核抽出液を用いるin vitroスプライシング・アッセイ系の検討を開始している。
今後、RNA 結合タンパク質の側からの探索とは反対側の塩基配列側からのアプローチも行う。これらのスプライシング促進配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、エクソンスキッピングを解除し得ることを明らかにし、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療の適応を検討する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

核酸とタンパク質が相互作用し、複合体を形成することにより、電気泳動時に核酸の移動度が低下する現象を利用した解析法である。RNAプローブをRNA-蛋白質複合体の形成を行い電気泳動で分離し、質量分析法を利用しLC-MS/MS解析しているが、正常DNA配列と変体DNA配列で差が認められていない。このため次のステップである制御因子のDNA結合配列の決定に進めていないため、やや遅れている。
定量性の感度を上げるために夾雑物を減らす必要がある。このためHeLa 細胞核抽出液を in vitro で反応させる系の条件検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

引き続きHeLa細胞核抽出液を用いるin vitroスプライシング・アッセイ系の確立を目指していき、RNAプローブに結合した蛋白がスプライシングに関与しているか否かを確認する。確認できた場合はプローブ特異的に結合したタンパクを分取し、質量分析法で分子種を同定する。またのミニ遺伝子を作成してスプライシング効率を測定する予定である。
その後、スプライソソームはsnRNPが集合することで形成され、活性化時と反応終了後にこれらは解離して再利用される。このサイクルはスプライソソームサイクルと呼ばれ、スプライソソーム活性が変化すればこのサイクルが乱れて、各snRNPの細胞内遊離量も変動すると予想される。そこで、snRNP量の変動を検出するスプリットルシフェラーゼレポーターを用いたスクリーニングを実施する。
しかしながらこれまでの経緯を踏まえ、スプライシング因子の同定には時間を要しそうなため、このスプライシング異常を制御因子の活性を低下させて修正できるかどうかを確認するため、阻害剤を用いる準備を行う。CRISPR-Cas9を用いて、対象遺伝子の特定部位に挿入し、変異RNAを恒常発現している細胞株を作成することを検討する。

Causes of Carryover

質量分析法を利用しLC-MS/MS解析しているが、正常DNA配列と変体DNA配列で差が認められていない。このため次のステップである制御因子のDNA結合配列の決定に進めていないため、対応する試薬の購入がないため余剰が生じている。