2019 Fiscal Year Research-status Report
塩基変異の引き起こすエクソンスキップを分子機構の解明と治療法の開発
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18K07873
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
成戸 卓也 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, プロジェクト研究員 (60438124)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | イントロン変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子のイントロン変異により引き起こされる現象により疾患に関わっている。エクソンスキップなどのメカニズムは既存のスプライシング予測プログラム等では解決不能であるもの解析を進めている。これは、保存されている配列から予測されたシスエレメントが実際に選択性の制御に関わっているか否かの解析にはシミュレーションでは未解決であり、スプライシングに関わる部位のコンセンサス配列は高等生物ではかなり緩いものであるため、未だに何らかの実験的な解析手段が不可欠である。また機構を解明することは治療法の開発につながる。
細胞株にCRISPR-Cas9を用いて変異株の作製を試みた。導入後に変異株が存在することは確認できたが、クローン化する過程で野生株のみ単離でき、変異株の樹立に苦渋している。正常および変異の配列に特異的に結合するスプライシングタンパクを単離するために、BirA 変異体を融合させたタンパク質を作成し各種蛍光RNAプローブと細胞核タンパクを結合させてスプライシング・アッセイ系の検討を行っていく。
イントロン変異で同様の現象が起こってか症例の蓄積を試みた。見出した変異は既存のアルゴリズムでも予測され、先天性葉酸吸収不全症（HFM）として報告した
今後、RNA 結合タンパク質の側からの探索とは反対側の塩基配列側からのアプローチも行う。これらのスプライシング促進配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、エクソンスキッピングを解除し得ることを明らかにし、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療の適応を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
In vitro系の確認が困難を極めているため、細胞株にCRISPR-Cas9システムにて変異を組み込んだ。しかし変異をバルクでは僅かな量を確認できるものの、変異株のクローン化が上手くいっていない。そのため細胞株の変更を準備している。再度組み込み領域のシークエンスを確認の上、CRISPR-Cas9システムで変異株を作製する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
正常および変異の配列に特異的に結合するスプライシングタンパクを単離するために、変異細胞株を作成し、E. Coli由来ビオチン・リガーゼ(BirA)の近接依存性ビオチン標識を介して一時的で弱い相互作用をするタンパク質相互作用 (PPI)の同定を行う。これはビオチンとストレプトアビジンの高親和性により、抗体利用に内在する非特異的結合を回避し精製時のコンタミネーションを排除する。
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| Causes of Carryover |
イントロンへ荷を組み込んだ細胞株の作成が遅滞しているため、このため次のステップに進めていないため、対応する試薬の購入がないため余剰が生じている。細胞株の作製方法の種類を増やして解析を進めていく。
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Research Products
(1 results)
