動脈管開存症の原因となる転写因子群のシグナル伝達パスウェイの研究

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07889
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 羽山 恵美子 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (00349698)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 動脈管 / シグナル伝達 / 転写因子

Outline of Annual Research Achievements

研究1および3：本研究では、ウサギ胎仔動脈管を主な対象として用いるが、ウサギc-FOSやPRDM6の免疫染色に適する市販の抗体がない。そこで、昨年度以来、大腸菌発現系を用いてウサギc-FOSの全タンパク質を発現させたが、これは発現されず、c-FOSの部分ペプチド3種類の内、最も短いペプチドのみが発現タンパク質として得られた。そのc-FOSペプチドを抗原としてアジュバントと共に複数回マウスに投与したが、抗体活性は上がらなかった。研究3の転写因子複合体の同定や研究5のIn vitro実験のためにも、対象遺伝子のクローニングが必要である。C-FOSはクローニング済みであり、今年度は、HSP70、TFAP2B、PRDM6のクローニングを行った。ウサギHSP70 (HSPA1B)のクローニングは完了し、c-FOSとGFPタグをつけて、293T細胞やラット平滑筋細胞株（A7r5）で発現させ、細胞内局在を確認できた。ウサギ胎仔血管RNA試料を用いて、TFAP2BとPRDM6のクローニングを実施したが、発現しているトランスクリプトが予想のものと異なっていたためか、PCR増幅されず、クローニングには至らなかった。
研究2：パスウェイ遺伝子の解析のために、RNA-seqの結果などを活用し、パスウェイに関係すると推測される遺伝子（産物）の市販抗体を用いて、ウサギ胎仔（妊娠30日）の動脈管及び周辺の大血管における局在を検討した。今年度は、17種類（15 ターゲット遺伝子）の抗体をウサギ30日胎仔動脈管に対して試したところ、その内10抗体が、周囲の大血管に比べて動脈管に特異性のある発現を検出した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究1（発現分布）については、ウサギc-FOSに対する抗体調製が不調であった。PRDM6のクローニングができず、抗体調製に進めなかった。
研究1, 3（転写因子複合体の同定）, 5（In vitro実験）については、PRDM6とTFAP2Bのクローニングが不首尾であったことにより、進捗が遅れている。
研究2（パスウェイ遺伝子解析）に関しては、昨年度、家兎（未熟・成熟）胎仔動脈管と主肺動脈、さらに高酸素処理、低酸素処理した家兎成熟胎仔動脈管と主肺動脈のRNA-seq解析を実施した。この結果から、ターゲットとなりうる14候補遺伝子や関連を推測できる遺伝子を決めた。これら14候補遺伝子（タンパク質）の一部と関連を推測される遺伝子複数に対する市販抗体を用いて、家兎満期胎児動脈管に対する反応を検討した。家兎成熟胎仔動脈管と主肺動脈を同時に観察できる組織試料に対して、17種類（15 ターゲット遺伝子）を試したところ、主肺動脈や大動脈に比べて動脈管への反応性が高いものや、動脈管の一部に特徴がある分布が見られた。RNA-seq解析でわかるmRNAの発現に加えて、このタンパク質レベルの発現分布の結果は機能を解釈する上で重要である。今年度は、家兎未熟胎仔動脈管、高酸素処理、低酸素処理した成熟胎仔動脈管の組織標本（パラフィン切片）も作成できたことから、これらの試料を用いて、残りの候補遺伝子についても動脈管における発現分布を検出したい。

Strategy for Future Research Activity

研究1の本研究のターゲット遺伝子であるc-FOSの動脈管における発現分布を検討するための抗体の調製を試みたが、大腸菌発現c-FOS部分ペプチド抗原としてマウスに投与したが、抗体は得られなかった。c-FOS遺伝子が哺乳類細胞で発現することは確認できているので、哺乳類細胞系でc-FOSタンパク質を発現させて、これを抗原として抗体を調製したいと考えている。
研究1, 3, 5に関しては、TFAP2B、PRDM6のクローニングを行ったが、発現しているトランスクリプトが予想のものと異なっていたためか、PCR増幅されなかった。これについては、RACE法を用いて、ウサギ胎仔動脈管に発現しているトランスクリプト種を調べつつクローニングしたいと考えている。その後、研究3 転写因子複合体の同定のために、対象遺伝子（ベイト）をクローニングし、タグ（GSTなど）をつけて哺乳類細胞（293T細胞など）で発現・精製し、ウサギ満期胎仔動脈管（全又は核）抽出タンパク質とインキュベーションして、共沈するタンパク質をSDS電気泳動法により分離する。このため、ベイト遺伝子のクローニングをまず進める。続いて、GST融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイにより相互作用するタンパク質の探索に進みたい。
動脈管の発達は、時期・部位特異的にエピジェネティックな転写制御を受ける可能性がある。一般にプロモーター領域のメチル化が増加すると、その遺伝子の発現は抑制される。研究4のプロモーターアッセイのために、対象遺伝子（TFAP2B, PRDM6, c-FOS, HSP70）のプロモーター領域について、まず通常のシークエンス解読を行いたい。最終的には、未熟・成熟胎仔動脈管のゲノムのバイサルファイト処理とシークエンス解読を行い対照と非処理と比較し、転写因子の活性化について検討したい。

Causes of Carryover

今年度の年度末近くに人件費が発生し、その正確な金額が不明であったことから、消耗品購入への出費を控えて人件費に不足がでないようにした。そのために、残額が生じた。この残額は、次年度の実験に必要な消耗品の購入に充てる予定である。