2019 Fiscal Year Research-status Report
癌促進的RNA編集の分子ネットワーク解明と新規食道癌治療戦略の探索
| Project/Area Number |
18K07910
|
|---|
| Research Institution | Kawasaki Medical School |
|---|
Principal Investigator |
増田 清士 川崎医科大学, 医学部, 教授 (00457318)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | RNA編集 / RNA結合蛋白質 / 食道扁平上皮癌 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続き「癌促進的RNA編集が関わるRiboCluster内関連分子の網羅的同定と意義の解明」を以下の様に行った。
a) 前年度に作成した「結合変化mRNAリスト」、「発現変化mRNAリスト」、「翻訳変化mRNA候補リスト」を本研究課題の基盤データとし、「発現変化mRNAリスト」を用いたpathway解析から抽出した候補遺伝子群（50遺伝子）に関して、「結合変化mRNAリスト」と統合して「癌促進的RNA編集標的遺伝子群」の抽出を行った。
b) a)で抽出した遺伝子群のうち、既知遺伝子情報から26遺伝子を「癌促進的RNA編集標的候補」とし、ADAR1ノックダウン細胞でのmRNA発現変化をqPCR法で解析した。
c) b)で発現量に変化がみられた遺伝子のうちアポトーシス制御因子GADD45aとIL-6を含む5遺伝子に関して、ESCC細胞株パネル（44種類）のうちADAR1発現量が充分である細胞株10種類を用いてmRNA発現量および蛋白質発現量を検討した。
d) c)で5遺伝子のmRNA発現量ならびに蛋白質発現量がともに充分であるESCC細胞株を用い、ADAR1ノックダウン細胞またはコントロール細胞で核と細胞質を分別し、csRBP特異抗体を用いた免疫沈降法（CLIP: crosslinking immunoprecipitation）でRNAを回収した。回収したRNA中に含まれる5遺伝子（上述）のmRNA量をqPCRで解析した。この結果、2つのmRNAでADAR1ノックダウンによってcsRBPとの結合が変化することが明らかとなった。
以上の結果から、同定した2遺伝子はADAR1による癌促進的RNA編集の標的候補である可能性が示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「癌促進的RNA編集が関わるRiboCluster内関連分子の網羅的同定と意義の解明」として、前年度作成した「結合変化mRNAリスト」、「発現変化mRNAリスト」、「翻訳変化mRNA候補リスト」にpathway解析と既知遺伝子情報を統合することで、複数の癌促進的RNA編集標的候補を抽出するに至った。しかしながらsiRNAを用いたADAR1のノックダウン効率が変化することによって、標的候補mRNAとcsRBPとの結合変化が充分に再現できない場合があり、相当数の候補mRNAが除外された。またこれに伴い、本年度に計画していた過剰発現やゲノム編集・ノックダウン系を用いた表現型への関与を検討することが一部できなかった。
前年度にゲノム編集技術を用いてADAR1ノックアウトESCC細胞の作成を試みたが、低遺伝子導入効率と細胞増殖抑制のため樹立することが不可能であった。このため、HEK293T細胞でADAR1ノックアウト細胞の作成を行うべく準備をすすめ、必要なツール作成を終了した。
以上から、本研究課題はおおむね順調に進展していると考える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. 本年度に得られた候補分子に加えさらに候補分子を同定し、これら分子の癌部・非癌部での発現や発現パターンとその臨床病理学的意義を公共データベースを用いて検討すると共に、不死化食道上皮でも機能検討を行い比較することで、癌特異性を検証し、さらなる絞り込みを行う(ESCC特異的な治療標的候補リスト)。
2. 「癌促進的RNA編集制御機構とその修飾法の解明および臨床医学的意義の検討」として、分子標的候補内の調節標的RNAに関して、ビオチン化したRNAプローブを作成し、csRBPとの結合領域をビオチンプルダウン法で決定する。さらに、DNA配列およびRNA配列をサンガーシーケンス法で同定し、当該領域内の機能性RNA編集部位を決定する。結合配列予測データベース（TarBase、CISBP-RNAなど）を用いて、同部位に相互作用するmiRNAや他のRBPを予測する。得られたmiRNAに関し、mimicするRNAやターゲット配列への結合を阻害するTarget Site Blockerを細胞に導入して、癌促進的RNA編集の癌細胞に対する作用への効果を評価する。一方、ゲノム編集法を用いて標的RNAのRNA編集点を改変し、csRBPおよび他のRBPとの相互作用や、癌細胞への効果を評価する。
3. 食道癌、胃癌、大腸癌におけるADAR1および上記で同定した癌促進的RNA編集標的候補に関し、公共データベース情報を用いて、各分子間の発現の相関や臨床病理学的因子との関連を明らかにし、同定した治療標的候補の消化管癌に対する効果の特異性を明らかにする。
|
| Causes of Carryover |
siRNAを用いたADAR1のノックダウン効率が変化することによって、標的候補mRNAとcsRBPとの結合変化が充分に再現できない場合があり、候補mRNAの絞り込みが予想以上に時間がかかった。このため本年度に計画していた過剰発現やゲノム編集・ノックダウン系を用いた表現型への関与を一部検討することができず、消耗品費（関連試薬等）で差額が生じた。
次年度はRNA編集領域の同定のためにビオチンプルダウン法やサンガーシーケンスならびに必要であれば次世代シーケンス解析を、また各種ノックアウト細胞の作成を計画しており、本年度未使用であった助成金と次年度分として請求した助成金を合わせて必要な抗体や試薬の購入に使用する。
|
| Remarks |
該当なし
|
-
-
[Journal Article] Toll‐Like Receptor 9 Plays a Pivotal Role in Angiotensin II?Induced Atherosclerosis2019
Author(s)
Fukuda D, Nishimoto S, Aini K, Tanaka A, Nishiguchi T, Kim‐Kaneyama J, Lei XF, Masuda K, Naruto T, Tanaka K, Higashikuni Y, Hirata Y, Yagi S, Kusunose K, Yamada H, Soeki T, Imoto I, Akasaka T, Shimabukuro M, Sata M
-
Journal Title
Journal of the American Heart Association
Volume: 8
Pages: e010860
DOI
Peer Reviewed
-
-
